未培養古細菌からの分岐メチル/アルキル補酵素 M レダクターゼの発現

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 1113 (2022) この記事を引用

2174 アクセス

3 引用

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

メタン生成菌と嫌気性メタン酸化古細菌 (ANME) は、地球規模の炭素循環において重要な役割を果たしています。メチル補酵素 M レダクターゼ (MCR) はメタン代謝における重要な酵素であり、メタン生成の最後のステップと嫌気性メタン酸化の最初のステップを触媒します。最近、分岐した mcr 遺伝子および mcr 様遺伝子が未培養の古細菌系統で同定されました。しかし、未培養古細菌からの MCR の集合と生化学は、ほとんど知られていないままです。ここでは、メタン生成菌、Methanococcus maripaludis での異種発現によって未培養古細菌からの MCR を研究するアプローチを紹介します。プロモーター、オペロン構造、および温度は、MCR 生成の重要な決定因子でした。組換えメタノコッカスおよびＡＮＭＥ－２ＭＣＲは両方とも宿主ＭＣＲと集合してハイブリッド複合体を形成するが、試験したＡＮＭＥ－１ＭＣＲおよびエチル補酵素Ｍレダクターゼは均質な複合体のみを形成した。構造モデリングと合わせて、これは、ANME-2 とメタン生成菌 MCR が構造的に類似しており、それらの反応方向が本質的な構造の違いではなく熱力学によって制御されている可能性が高いことを示唆しています。

メタン生成菌またはメタン生成古細菌は、地球上で最も初期の微生物生命体の 1 つと考えられており 1,2、嫌気性メタン酸化古細菌 (ANME) とともに、地球規模の炭素循環において極めて重要な役割を果たしています。現在、メタン生成菌は、H2/CO2、ギ酸塩、酢酸塩、C1 メチル化化合物 3 や最近発見された石炭成分 4,5 や長鎖アルカン 6 などのさまざまな基質を使用して、無酸素環境で年間約 10 億トンのメタンを生成しています。酸素欠乏の海洋堆積物では、生物起源のメタンの約 90% が、逆メタン生成経路 7 を使用して ANME によって CO2 に酸化され、大気中へのメタンの放出が軽減されると推定されています。

すべての ANME と多くのメタン生成菌は、単一種培養物として培養されていないままです。環境メタゲノムと濃縮培養に基づくと、ANME は生化学的および遺伝的にメタン生成菌と密接に関連しており、メタン生成とは逆方向の嫌気性メタン酸化 (AOM) に類似した一連の酵素を共有しています 8,9,10,11。 ANME は炭素源とエネルギー源としてメタンを使用し、メタンから共生硫酸塩還元細菌パートナー 9、12、13 または硝酸塩 14、Fe(III)15、16、17、Mn(IV)15 などの無機電子受容体に電子を渡します。。既知の ANME は単一の分類群を構成せず、「Ca. Methanophagales」（ANME-1）および Methanosarcinales（ANME-2 および ANME-3）目に属します10。メタノサルシナ目にもメタン生成菌が含まれています。 ANME の生理学的および生化学的な詳細は、純粋培養の欠如と濃縮物の成長の遅さのため、ほとんど不明のままです 8,18。

メチル補酵素 M (CoM) レダクターゼ (MCR) は、嫌気性メタン代謝の重要な酵素です 19。これは、メタン生成における最後の CH4 生成反応と、AOM における最初の CH4 活性化反応を触媒します。 MCR 反応 (反応 1) の可逆性は、Methanothermobacter marburgensis MCR20 を用いて実験的に実証されています。最近、関連するアルキル補酵素 M レダクターゼ (ACR) が、嫌気性アルカン酸化古細菌 (ANKA) による短鎖アルカン (エタン、プロパン、ブタンなど) の酸化を触媒すると提案されました 21,22,23,24。

MCR 複合体は、2 つの活性部位のそれぞれに Ni 含有テトラピロール補酵素 F430 の分子を含むヘテロ三量体 (αβγ)2 の二量体で構成されています 25。各 F430 はタンパク質複合体内に深く埋め込まれており、複数のサブユニット、McrA、A'、B、および G、または McrA'、A、B'、および G'26、27 から形成される 50 Å チャネルによってのみ外部からアクセスできます。 F430 の Ni(I) 酸化状態は活性に必要です。 Ni(II)/Ni(I) カップルは、-600 mV 未満の極度に負の酸化還元電位 (Eo') を持っています 28。そのため、MCR は非常に酸素感受性が高く、ATP 依存性の還元活性化には複雑な酵素系が必要です 29。 McrA サブユニットには複数の独特な翻訳後修飾 (PTM) が存在し、MCR の安定性と活性を微調整します 30、31、32。 ANME-1 MCR33 とエチル補酵素 M レダクターゼ (ECR)34 の結晶構造は解明されていますが、ANME 酵素と ANKA 酵素の両方のアセンブリと生化学的特性はまだ十分に理解されていません。 Methanosarcina acetivorans における ANME-1 MCR をコードする遺伝子の異種発現は、組換え生物によるメタン酸化を刺激し、これらの酵素の役割についてのさらなる証拠を提供しました 35。最近、Methanothermococcus okinawensis MCR がモデルメタン生成菌 Methanococcus maripaludis で異種発現されました 36。ここで我々は、未培養古細菌からの酵素複合体の研究への道を開く、M. maripaludis における MCR の異種発現をさらに開発しました。

最近の環境ゲノミクス研究により、現在まで培養されていない潜在的なメタン生成菌および ANME の多くの古細菌系統が明らかになりました 10。ここでは、ゲノム分類データベース (GTDB) から集められた 1,070 個の古細菌ゲノムにわたる MCR ホモログの分布を、完全性 > 80%、汚染度 < 10% で調査しました。合計 307 のゲノムには、MCR サブユニットをコードするために必要な 3 つの遺伝子 (mcrA、mcrB、および mcrG) がすべて含まれていました (補足データ 1)。 1,070 個のゲノムすべてに基づくランク正規化系統樹 37 では、これらの mcr を含む古細菌には、メタン生成菌、ANME-1、ANME-2、ANKA、および代謝型が不明なその他の古細菌が含まれており、これらの遺伝子を共有しない系統が点在していました (図1）。古細菌における mcr 遺伝子の広範な分布は、メタン代謝が古細菌の根におそらく存在する古代の形質であるという仮説を裏付けています 38,39,40。

メタン生成菌 (n = 252)、ANME-1 クレード (n = 5)、ANME-2 (n = 20)、ANKA (n = 9)、およびその他の古細菌を含む 1,070 の古細菌ゲノムから合計 307 個の mcr 遺伝子が同定されました。未知の代謝 (n = 21)。アクセッション番号は補足データ 1 に示されています。色の濃淡: 緑色、メタン生成菌。紫、ANME-1 古細菌。赤、ANME-2 古細菌。オレンジ色、提案された ANKA。灰色、機能不明のmcrを含む古細菌。オペロン構造 (mcrBDCGA、mcrBDGA、または mcrBGA) は、ランク正規化系統樹の外側の複数のリングで表されます。 BDCGA (青色)、mcrBDCGA オペロン。 BDGA (シアン色)、mcrBDGA オペロン。 BGA (マゼンタ)、mcrBGA オペロン。珍しいことに (黒で)、mcr 遺伝子には認識されている 3 つの共通オペロン構造が欠けています。単一ゲノムの複数のヒットは、mcr の複数のコピーの存在を示します。分類学的分類: P 門、C クラス、O 目、F 科、G 属、S 種。 mcr のない系統は注文レベルで切り捨てられました。

構造遺伝子に加えて、多くの mcr オペロンは 2 つのアクセサリータンパク質、McrC および McrD をコードしていました。 McrC と D の役割は十分に特徴づけられていませんが、McrC は MCR 活性化複合体に関与することが示されており 29、McrD は複合体への補酵素 F430 の付加を促進する可能性があります 41。 3 つの主要な mcr オペロン構造、mcrBDCGA、mcrBDGA、および mcrBGA が同定され、これらは強い系統発生シグナルを持っていました (図 1)。注目すべきことに、メタン生成菌と ANME-2 のゲノムには主に mcrBDCGA オペロンと mcrBDGA オペロンが含まれていました。一方、ANME-1 ゲノムは、別の遺伝子座に mcrC を持つ短い mcrBGA オペロンを持っていました (図 1)。 ANKA ゲノムは主に 1 つ以上の mcrBGA および/または mcrBAG オペロンを持っていました。 ANME-1 および ANKA ゲノムに mcrD 相同体が存在しないことは、メタン生成菌由来の酵素との他の大きな違いを象徴している可能性があります。例えば、それらは、修飾されたニッケル含有Ｆ４３０補因子、例えば、ＡＮＭＥ－１ＭＣＲ３３由来のチオメチル化Ｆ４３０およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓＥｔｈａｎｏｐｅｒｅｄｅｎｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍＭＣＲ３４由来のジメチル化Ｆ４３０を含む。

mcr の遺伝子重複は古細菌ではよく見られます。メタン生成菌の中で、メタノバクテリア目、メタノコッカス目、メタン微生物目からの多くのゲノムには、mcrBDCGA の 1 コピーと、mcrBDGA または mcrBGA のいずれかの 2 番目のコピーがあります (補足データ 1)。 M. marburgensis では、2 つの MCR アイソザイムが H2 濃度に応じて差次的に発現されます 42、43、44。このことは、mcr の重複がさまざまな生育条件への生理学的順応に役割を果たしている可能性を示唆しています。一方、提案されている ANKA ゲノムには複数の mcrBGA/BAG オペロンが含まれることが多く 21,45,46 、mcr の重複によりその機能がメタンから多炭素アルカン代謝に拡張された可能性があることが示唆されています。

M. maripaludis における MCR の異種発現は体系的に最適化されました。まず、構成的ヒストンプロモーター (PhmvA) 36 を、リン酸制限により発現を開始し、発現と増殖を部分的に分離する最近開発されたリン酸依存性プロモーター (Ppst) 47 と比較しました。 Flag-Strep2タグをMethanococcus aeolicus mcrBDCGAオペロン由来のMcrGのN末端に付加した（図2a）。以前の研究のウェスタンブロッティングに基づくと、PhmvA および Ppst プロモーターは、それぞれ総タンパク質の 2.4% および 5.8% の M. aeolicus MCR (MCRaeo) を生成しました 47。したがって、Ppst プロモーターは優れており、その後の実験で利用されました。次に、タグの位置の影響を調べました。 MCRaeoのMcrG(NG)のN末端、McrB(NB)のN末端、またはMcrA(CA)のC末端にFlag-Strep2タグを付加した。精製されたタンパク質の同一性は、SDS-PAGE後の質量分析によって確認されました（図2b）。 McrB、G、A サブユニットに加えて、少量の McrD が同定されました。 3 つのケースすべてにおいて、MCRaeo 収量は全細胞タンパク質の約 6% であり、タグの位置がタンパク質生産レベルに影響を及ぼさないことを示唆しています。精製されたMCRaeoの紫外可視（UV-vis）スペクトルは、425 nmで最大吸収ピークを示しました。これはMCRホロ酵素に典型的であり、メタノール抽出されたF430の430 nmでの吸収最大よりもわずかに低かった（図2c）。モル吸光係数ε430nm = 22,500 M-1 cm-1およびHPLCベースの分析（補足図S1）に基づいて、NBまたはNGタグを含む精製MCRaeoはF430と完全に組み立てられましたが、CAタグはF430含有量を減少させました。 30% 減少しました (図 2c)。したがって、タグの位置は F430 のアセンブリに影響し、NB タグと NG タグはホロ MCR の生成に適していました。最後に、組換えMcrAaeoのPTM（チオグリシン、1-N-メチルヒスチジン、5-(S)-メチルアルギニン、および2-(S)-メチルグルタミンを含む）の存在が、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS）によって確認されました。 /MS) (補足表 1)。これは、我々の異種発現系が、M. maripaludis および密接に関連する M. okinawenesis MCR で見出されたものと同じ PTM をもたらすことを示しました。

a M. aeolicus (mcraeo) および M. maripaludis (mcrmar) の mcr オペロン構造。 b M. maripaludis から Strep-tag アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製された組換え MCRaeo および MCRmar の SDS-PAGE 分析。標準に基づく分子量を左側に表示します。 Flag-Strep2 タグは、McrA の C 末端 (CA)、McrB の N 末端 (NB)、または McrG の N 末端 (NG) 位置に追加されました。すべてのサブユニットは MALDI-TOF MS によって同定され、右側にラベルが付けられました。 McrG1 および McrG2 は、それぞれタグ付きおよびタグなしの McrG を表します。 c M.マルブルゲンシスMCRから抽出された補酵素F430と比較した、精製組換えMCRaeoおよびMCRmar（すべて7.5 mg mL-1濃度）の紫外可視スペクトル。 d LC-MS/MSによって測定された、精製組換えMCRaeo複合体の各サブユニットにおけるM. aeolicus（灰色）対宿主M. maripaludis（オレンジ色）MCRの相対存在量。各サブユニットの総タンパク質中の M. maripaludis タンパク質の割合が表示されます。

組換えMCRaeoはホロ複合体に集合しましたが、SDS-PAGEでは、NGタグ付き複合体には追加のMcrG2サブユニットが含まれていることが示されました（図2b）。質量分析により、McrG1 と G2 はそれぞれ Flag-Strep2 タグ付き McrGaeo とタグなしの宿主 M. maripaludis McrGmar であることが同定されました。このキメラ現象は、他のタグ位置で発現されたMCRaeoおよび組換えM. maripaludis MCRでも観察されました（図2b、d）。 M. maripaludis McrG は、タグの位置に関係なく、全 McrG の 30 ± 6% を占めました。 McrG とは対照的に、組換え MCRaeo 複合体の LC-MS/MS 分析では、少量の M. maripaludis McrA および McrB しか見つかりませんでした (図 2d)。キメラ複合体は、ネイティブ PAGE およびインタクトタンパク質質量分析によってさらに特徴付けされました (図 3)。精製された組換えMCRaeoおよびMCRmarについて、ネイティブPAGEで2つの複合体（複合体IおよびII）が観察されました（図3a）。 2つの複合体のSDS-PAGEでは、余分なタグのないM.マリパルディスMcrGの存在下でそれらが異なることが判明した（図3b）。インタクトタンパク質質量分析により、複合体IおよびIIの分子量はそれぞれ288.4および283.8 kDaであることが決定されました（図3cおよび補足表2）。したがって、複合体 I は α2β2h2f2 複合体と一致しました。ここで、α、β、h、および f は、それぞれ M. aeolicus の McrA、McrB、タグ付き McrG、および F430 に対応します。複合体 II は、α2β2hγf2 とタグのない M. maripaludis McrG に対応する γ を一致させました (図 3d)。これらの結果は、McrGが異なる起源のMcrAおよびBサブユニットに容易に結合することを示した。

精製された組換えMCRaeoおよびMCRmarのNative-PAGE分析。どちらの構築物も、McrG の N 末端に追加された Flag-Strep2 タグを持っていました。 b MCRaeo の 2 つの複合体をネイティブ PAGE ゲルスライスから溶出し、SDS-PAGE で分析し、銀染色しました。 c MCRaeo複合体IおよびIIの天然分子量は、インタクトタンパク質質量分析法により、それぞれ288.4および283.8 kDaと測定されました。ピークの電荷はラベル付けされています。 d 錯体 I および II のモデル。 A、B、および Gaeo は、それぞれ M. aeolicus の McrA、McrB、および McrG サブユニットを表します。 Gmar は、タグのない宿主 M. maripaludis McrG を示します。黒い線はタグを象徴しています。 FはコエンザイムF430の略です。

アクセサリータンパク質McrCおよびMcrDは、メタン生成菌のmcrオペロンでは高度に保存されていますが、ANMEおよびANKAのmcrオペロンには存在しないことがよくあります。 MCR アセンブリにおけるそれらの役割を調査するために、mcrBDGA、mcrBCGA、および mcrBGA を含む短縮型 M. aeolicus mcr オペロンを構築しました。すべての場合において、Flag-Strep2 タグが NG 位置に追加されました。 3つの短縮型オペロンすべてからのMCRaeoの発現により、完全なmcrBDCGAオペロンの複合体と同様の複合体が得られました（図4a、b）。 UV-visスペクトル（図4c）およびHPLC分析により、精製MCRaeo中のF430の完全な相補体が確認されました。さらに、主要な PTM も存在しました (補足表 1)。ただし、切断された mcr オペロンの発現レベルは完全なオペロンの発現レベルよりも約 3 倍低かった (図 4d)。ただし、タンパク質レベルの低下の原因は現在不明です。これらの結果は、mcr オペロン内の mcrCD の存在が MCR アセンブリおよび PTM に必要ではないことを実証しました。

Strepタグアフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製された組換えMCRaeoのSDS-PAGE分析。すべての構築物には、McrG の N 末端に Flag-Strep2 タグが付加されていました。オペロン構造は各レーンの上に標識されています。標準に基づく分子量を左側に表示します。すべてのサブユニットは MALDI-TOF MS によって同定され、右側にラベルが付けられました。 b LC-MS/MS によって測定された、共精製複合体の各サブユニットにおける M. アエオカス (灰色) 対宿主 M. マリパルディス (オレンジ) MCR の相対存在量。各サブユニットの総タンパク質中の M. maripaludis タンパク質の割合が表示されます。 c MCRから抽出された補酵素F430と比較した、精製MCRaeo（すべて7.5 mg mL-1濃度）のUV-visスペクトル。 d ウェスタンブロッティングによって決定された組換えMCRaeoの発現レベル。エラーバーは、4 つの独立した培養物の標準偏差を表します。

M. marburgensis の McrC が、外側にコードされている MCR 活性化複合体と共精製されるという観察に基づいて、McrC はトランスで作用する、つまり mcrC と mcr オペロンの共転写はその機能に必要ではない、と提案されました。 mcrオペロン29。この仮説を検証するために、2 つのプルダウン実験が実行されました。まず、M. aeolicus mcrBDCGA 遺伝子を、McrC (McrCaeo) の N 末端に Flag-Strep2 タグを付けて発現させました。 M. aeolicus (プラスミドから転写) と宿主 M. maripaludis (ゲノムから転写) の両方の McrA、B、および G サブユニットが、タグ付き McrCaeo と同時精製されました (図 5a、c)。これは、McrC が相互作用していることを示唆しています。共転写とは無関係に両方の MCR と直接反応します。第二に、Flag-Strep2タグ付きM.マリパルディスMcrC（McrCmar）のみをプラスミドから発現させた。タグ付けされたMcrCmarも、ゲノムから発現された3つのMCRサブユニットと一緒に精製されました（図5a）。さらに、mcr オペロンに由来しない他のタンパク質は、タグ付き McrCaeo および McrCmar の両方で同時精製されました。これらのタンパク質には、以前に同定された2つのMCR活性化複合体成分（成分A2およびメタン生成マーカータンパク質7）29と、他の2つのメタン生成マーカータンパク質3および17が含まれていました（図5a）。

a McrCaeo 構築物は、McrC の N 末端に Flag-Strep2 タグが付加された完全な M. aeolicus mcrBDCGA オペロンを持っていました。 McrCmar コンストラクトには、N 末端 Flag-Strep2 タグを持つ M. maripaludis mcrC のみが含まれていました。 McrCaeo および McrCmar で同時精製したタンパク質を SDS-PAGE で分離し、MALDI-TOF MS で同定しました。 McrCaeo のみで精製されたタンパク質は赤色でラベルされています。 MCR サブユニットに加えて、共精製されたタンパク質 (太字) には、M. maripaludis A2 タンパク質 (遺伝子座タグ Mmp_0620)、MMP3 (メタン生成マーカータンパク質 3、遺伝子座タグ Mmp_0154)、MMP7 (メタン生成マーカータンパク質 7、遺伝子座タグ Mmp_0421)、MMP17 が含まれます。 (メタン生成マーカータンパク質 17、遺伝子座タグ Mmp_0656)、および熱ショックタンパク質 Hsp20 (遺伝子座タグ Mmp_0684)。 b McrDaeo コンストラクトには、McrD の N 末端に Flag-Strep2 タグが付加された完全な M. aeolicus mcrBDCGA オペロンがありました。 McrDaeo で同時精製したタンパク質は SDS-PAGE で分離し、MALDI-TOF MS で同定しました。 c LC-MS/MSによって測定された、精製複合体の各サブユニットにおけるM. aeolicus（灰色）対宿主M. maripaludis（オレンジ色）MCRの相対存在量。各サブユニットの総タンパク質中の M. maripaludis タンパク質の割合が表示されます。

2 つの実験により、McrD がトランスで機能することが確認されました。まず、宿主M.マリパルディスMcrDは、mcrDを欠く完全および切断型mcrオペロンの両方から発現された精製組換えM.アエオカスMCR中に存在した(図4a)。第二に、McrD (McrDaeo) の N 末端で Flag-Strep2 タグをコードする M. aeolicus オペロンを、プルダウン実験のために M. maripaludis 内のプラスミドから発現させました。 M. aeolicus と M. maripaludis の両方からの 3 つの MCR サブユニットすべてがタグ付き McrDaeo と同時精製され（図 5b、c）、McrDaeo がゲノムから発現された宿主 MCR と相互作用したことを示唆しています。

強力な発現システムを適用して、未培養古細菌から MCR を生成しました。 2 つの ANME-1 MCR、4 つの ANME-2 MCR、および 1 つの ECR が異種発現用に選択されました (補足表 3)。すべての場合において、Flag-Strep2 タグは、Ppst プロモーターの制御下で McrG の N 末端に付加されました。温度は、ANME MCR および ECR の生成にとって重要な要素であることが確認されました。宿主 M. maripaludis の最適増殖温度である 37 °C では、qRT-PCR によって定量化された mRNA コピー数がより高いレベルの mRNA を示唆したにもかかわらず、ウェスタンブロッティングでは低レベルの組換え MCR のみが検出されました（補足図 S2）。組換えANME-1_G37 MCRの場合、ネイティブ宿主MCRよりも優れています（補足図S3）。多くの ANME メタゲノムが温度が 2 °C 付近の深海の堆積物から取得されたことを考慮して、より低い温度での発現を調べました。 M. maripaludis の最低温度 (25 °C) 付近で増殖した後、ANME MCR および ECR の発現は大幅に改善されました。たとえば、ANME-1_BS および ANME-2b_HR1 は、総細胞タンパク質の 1 ～ 1.5% を占めていました (補足図 S2)。これらの結果は、ANME MCR および ECR が高温では不安定であるか、M. maripaludis で発現させた場合に分解されやすいことを示唆しました。

精製されたANME-1_BS MCR (MCRANME-1_BS)、ANME-2b_HR1 MCR (MCRANME-2_HR1)、およびCaのタンパク質組成。エタノペレデンス・サーモフィラム E50 ECR (ECRE50) をさらに研究しました (図 6a)。質量分析により、精製されたMCRANME-1_BSおよびECRE50は、宿主M. maripaludis MCRを含まずに、3つのサブユニットMcrA、B、およびGをすべて含んでいることが確認されました（図6b、c）。対照的に、ANME-2b_HR1のタグ付きMcrGは3つのM. maripaludis MCRサブユニットと同時精製され（図6d）、McrGANME-2_HR1とMCRmarがハイブリッド複合体を形成していることが示唆されました。タンパク質配列アラインメントにより、ANME-1 の McrG はメタン生成菌、ANME-2、および Ca のものよりも長い C 末端伸長を持つことが示されました。 E.サーモフィラム（補足図S4）。この拡張により、宿主のメタノコッカス MCR との相互作用が阻害される可能性があります。

a MCRANME-1_BS、MCRANME-2b_HR1、および ECRE50 の一般情報とオペロン構造。 b〜d 25℃で増殖させたM. maripaludisから生成した精製MCRANME-1_BS、ECRE50、およびMCRANME-2_HR1のSDS-PAGE分析。標準に基づく分子量を左側に表示します。タンパク質の同一性（右側に標識）は、MALDI-TOF MS によって確認されました。タグ付き McrGANME-2_HR1 はホスト MCRmar と同時精製されました。 e M. maripaludis McrA、B、G 複合体への McrGANME-1_BS (青) および McrGANME-2_HR1 (赤) のローカルドッキングシミュレーションの合計スコア (ロゼッタエネルギー単位; REU) 対 I_rmsd プロット。プロットには 60,000 のスコアリングモデルが表示されます。 McrGANME-1_BS ドッキングから得られた最良のモデルの I_rmsd は 5.869 Å、合計スコアは -4965.008 でした。 McrGANME-2_HR1 ドッキングから得られた最良のモデルの I_rmsd は 1.848 Å、合計スコアは -5133.935 でした。 I_rmsd < 2.5 Å の 10 個の最低エネルギースコアが黒いボックス内にラベル付けされています。 f、g M. maripaludis にドッキングする McrGANME-1_BS (マゼンタ、f) および McrGANME-2_HR1 (マゼンタ、g) のシミュレーションで I_rmsd が最小となる構造モデル McrA (緑)、B (シアン)、G (黄) ）複雑な。タンパク質サブユニットは漫画で示され、F430 と CoB-SH は棒モデルで示されています。明確にするために、M. maripaludis McrA (緑色)、A' (黄色)、B (シアン)、および ANME McrG (マゼンタ) サブユニットで構成される 1 つの活性部位と 1 つの F430 のみを示しています。 F430の周囲8Å以内のアミノ酸が表面表現として示されている。 h F430 の周囲 8 Å 以内の McrGANME-2_HR1 の 10 個のアミノ酸を左側にラベルし、棒モデルで示します。

MCRハイブリッド複合体形成の構造的基礎は、計算モデリングによってさらに分析されました。 M. マリパルディス MCR 複合体の相同性モデルは、RosettaCM48 を使用して構築され（補足図 S5）、RosettaDock49,50 による ANME-1_BS および ANME-2b_HR1 の McrG とのタンパク質ドッキングに使用されました（図 6e-g）。 McrGANME-2_HR1とM. maripaludis MCRのインシリコドッキングは、最小の界面二乗平均平方根偏差（I_rmsd）= 1.848Åで成功しました（図6e）。このモデルでは、McrGANME-2_HR1の10個のアミノ酸がF430の周囲8Å以内に同定され（図6h）、報告されたF430結合部位（補足図S4）と一致しています26、51。対照的に、McrGANME-1_BSとM. maripaludis MCRのドッキングの品質は低く（I_rmsd = 5.869Å）（図6e）、McrGANME-1_BSとF430の間に8Å以内の相互作用表面は観察されませんでした（図6f）。これらのシミュレーションは、ANME-2 およびメタノコッカス MCR サブユニットがハイブリッド複合体を形成できるのに対し、ANME-1 MCR は均一な複合体としてのみ精製されるという実験データと一致しました。

この研究では、Ppst プロモーターの制御下で McrG の N 末端に Flag-Strep2 タグを備えた M. maripaludis における強力な MCR 発現システムが開発されました。このシステムは、構成的 PhmvA などの他のプロモーターに比べて MCR 発現を 2 ～ 3 倍増加させ、タグ付きホロ MCR の迅速な精製を可能にしました。このシステムを使用して、組換え MCR が補酵素 F430 で完全に構築され、M. maripaludis MCR に存在する PTM が含まれていました。現在、ANME MCR の収量はメタン生成 MCR よりも低いですが、この研究は、未培養古細菌からの MCR ホモログの生化学的および機構的研究にとって重要な一歩を踏み出しました。

我々の異種発現により、MCR アセンブリの機構に関する洞察が得られました。以前に、我々は M. maripaludis における MCR 生産のための順序集合モデルを提案しました 36。このモデルでは、mcr オペロンの転写は、正しい PTM を備えた成熟ホロ酵素へのサブユニットの翻訳および組み立てと同時に行われました。ここで報告された実験は、このモデルの重要なテストを提供するように設計されたものではありませんが、元のモデルが単純すぎたことを示唆しています。たとえば、アクセサリータンパク質McrCおよびMcrDの遺伝子は、以前のモデルが示唆したように、F430挿入および正しいPTMを伴う完全なMCRアセンブリのためのオペロンには必要ありませんでした。ただし、オペロンに mcrC および/または mcrD が存在しない場合、M. maripaludis では複合体生成レベルが約 60% 減少しました。さらに、プルダウン実験により、これらのアクセサリータンパク質がトランスで機能できることが実証されました。これらの結果は、オペロン構造が重要な役割を果たしている可能性があるが、MCR アセンブリには必須ではないことを示唆しており、これはほとんどの ANME および ANKA mcr オペロンに mcrC/D が欠如していることと一致しています。第二に、McrA サブユニットと McrB サブユニットのキメラ化は秩序集合モデルが予測したように小さかったが、McrG は高度にキメラ化されており、異なる起源から複合体を形成していました。アセンブリ中に、McrG の添加の選択性が McrA および McrB よりも低い可能性があります。たとえば、McrG は、McrAB 複合体に加わる最後のサブユニットとなり、補酵素 F430 を取り込む可能性があります。あるいは、McrG はモバイルであってもよい。順序集合モデルによって予測されたように最初に MCR に集合した後、成熟した天然 MCR と組換え MCR の間で交換されます。これらの仮説と他の仮説を区別するには、さらなる実験が必要です。

私たちのタンパク質の特性評価と構造モデリングにより、ANME-2 とメタノコッカス MCR サブユニットがハイブリッド複合体を形成できることが実証され、これらは当初考えられていたよりも構造的および生化学的に互いに類似していることが示唆されました。 ANME-2 古細菌はメタノサルシナレス目に属し、メタノコッカス目とは系統発生的に異なります。 M. marburgensis MCR は、in vitro で可逆的な CH4 生成/CH4 酸化反応を触媒することが示されており 20、ANME 古細菌は一部のメタン生成堆積物で優勢であることが判明しています 52、53、54、55 が、そのような可逆性は生理学的条件下ではまだ証明されていません。我々の結果は、メタン生成とメタン栄養が、メタン生成菌とANMEのMCRの本質的な違いではなく、熱力学的ドライバーによって調節されているというさらなる証拠を提供しました。

ほとんどの古細菌ゲノムは、ゲノム分類データベース (GTDB、https://gtdb.ecogenomic.org/) から取得されました。 ANME-1_BS ゲノム (アクセッション番号 FP565147) は、NCBI ヌクレオチドデータベースから取得したものです。 Ca. エタノペレデンス・サーモフィラム E50 ゲノムは、GenBank アセンブリーからダウンロードされました (アクセッション番号 GCA_905171685.1) 24。分類学的割り当ては、相対進化的分岐の分析を使用して GTDB リリース 95 と一致するようにされました 37。ゲノムの完全性と汚染について CheckM56 を使用して分析しました。この研究では、完全性が 80% 以上、コンタミネーションが 10% 未満の 1,070 個のゲノムのセットが選択されました。 mcr遺伝子は、クエリ配列としてMethanococcus maripaludis S2株およびMethanosarcina acetivorans株C2A MCRを使用してtblastnを使用して検索されました。同定された対象配列は、Expect (E) 値が 1e-5 より大きい場合には除外されました。同定された mcr 遺伝子が同じコンティグおよび鎖上に位置し、2 つの隣接する遺伝子間の距離が 250 bp 未満である場合、オペロン構造が認識されました。

ゲノム分類ツリーは、ハッテントワー研究所によって開発された Python ベースのコマンドラインツリー描画ツールであるグラフィカル系統解析 57 を使用して構築されました。ゲノムの分類と命名は、GTDB リリース 9537 と一致しています。発見されたオペロンのパターンは、円形系統樹の外側の複数のリングで表されていました。単一ゲノムの複数のヒットは、そのゲノムに複数の mcr のコピーが存在することを示します。

組換え M. maripaludis 株を 25 または 37 °C で嫌気的に増殖させました。細胞は、5 mL の最小ギ酸培地 (McF) または富ギ酸培地 (McFc、McF プラス 2 g L-1 のカザミノ酸) を含む 28 mL のアルミニウムキャップ付きゴム栓密封チューブ内で培養されました 58。ヘッドスペースは 104 kPa の N2/CO2 (4:1、vol/vol) でした。１．５Ｌの培養物を、限定（８０μＭ）リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を含むギ酸ベースの培地ＭｃＦ中で増殖させた。接種材料を5 mLのMcFc中で事前に増殖させ、次に80μM K2HPO4を含むMcFに移した後、4%容量を実験培養物に接種した。必要に応じてピューロマイシン (1.25 または 2.5 μg mL-1) を追加しました。接種前に、3 mM 硫化ナトリウムを硫黄源として添加しました。

mcr 遺伝子は、93 bp Ppst プロモーターの制御下で Flag-Strep2 タグを備えた pMEV4 シャトルベクターにクローニングされました 47。タンパク質発現のために、ポリエチレングリコール媒介形質転換法60を使用して、プラスミドをM. maripaludis S000159に形質転換した。培地に1.25または2.5μg mL-1のピューロマイシンを添加することにより、プラスミドを組換えM.マリパルディス株内で維持した。選択された形質転換体のコロニーは、PCR および配列決定によって確認されました。

組換え MCRaeo または MCRmar を発現する M. maripaludis 培養物を、80 μM K2HPO4 を含む 1.5 L McF 中で 600 nm での吸光度が 0.5 ～ 0.7 に達するまで 37 °C で増殖させました。タンパク質の精製は好気条件下で実行されました。細胞を 4 °C、17,700 × g で 20 分間遠心分離して回収し、100 mM Tris-HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (Roche、ニューヨーク) を含む 5 mL の結合緩衝液に再懸濁しました。、ミズーリ州、米国）。細胞を、氷上で２０分間、出力を４に設定し、デューティサイクルを４０％に設定して、５秒のオン／オフのサイクルを使用する超音波処理（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳｏｎｉｃＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒＭｏｄｅｌ１００）によって溶解した。細胞溶解物を 4 °C、17,700 × g で 20 分間遠心分離して、細胞破片を除去しました。上清画分を、結合バッファーで平衡化した 1 mL の Strep-Tactin Superflow Plus 樹脂 (IBA Lifesciences、ゲッティンゲン、ドイツ) を含むカラムにロードしました。カラムを結合緩衝液で洗浄し、タンパク質を100 mM Tris-HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、および2.5 mM デスチオビオチンを含む溶出緩衝液で溶出した。溶出画分を脱塩し、Amicon Ultra 遠心フィルター (Millipore、分子量カットオフ 10 kDa) を使用して 5000 × g、4 °C で 20 分間遠心分離して濃縮し、50 mM Tris-HCl ( pH 7.6）。次いで、タンパク質溶液を、NGC液体クロマトグラフィーシステム(Bio-Rad)を使用して、緩衝液Aで平衡化したQ-Sepharose XK16陰イオン交換カラムにロードした。タンパク質は、0%から100%の緩衝液B(緩衝液Aプラス1M NaCl)の直線勾配で溶出されました。コエンザイム F430 を含む着色画分をプールし、10 kDa カットオフの遠心フィルターを使用して 1 mL に濃縮しました。タンパク質濃度は、Pierce BCA タンパク質アッセイキット (Thermo Fisher Scientific) を使用して測定しました。

ANME MCR を発現する M. maripaludis 培養物を、600 nm での吸光度が 0.5 ～ 0.7 に達するまで、80 μM K2HPO4 を含む 1.5 L McF 中で 25 °C で増殖させました。 ANME MCRの精製は、上記のようにStrep-Tactinアフィニティークロマトグラフィーを使用して実行されました。 10 kDa カットオフの遠心フィルターで濃縮した後、Strep-Tactin XT 磁気ビーズ (IBA Lifesciences、ドイツ、ゲッティンゲン) を使用して、メーカーの指示に従って ANME MCR をさらに精製しました。

F430 を含むタンパク質の定量では、光路長 10 mm の石英キュベット内のサンプルを使用して、Agilent Cary 60 UV-Vis 分光計 (Agilent Technologies Inc.、パロアルト、カリフォルニア州、米国) で紫外可視吸収スペクトルを記録しました。 F430 の量は、430 nm でのモル吸光係数 ε = 22,500 M-1 cm-1 を使用して計算されました。

F430 抽出では、精製した MCR を等量の 100% メタノールで処理し、沈殿したタンパク質を 17,000 × g で 5 分間遠心分離して除去しました。遊離 F430 を含む上清を、前述のとおりダイオードアレイ検出器 (DAD) VL+ を備えた Agilent 1260 Infinity システムで C18 カラム (4.6 × 100 mm、3.5 μm) を使用して高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 分析に供しました。軽微な変更。溶媒 A は水中の 10% アセトニトリルおよび 0.5% ギ酸であり、溶媒 B は 100% アセトニトリル中の 0.5% ギ酸でした。流速は0.5 mL min-1、注入量は30 μLでした。直線勾配溶出は次の方法で使用されました: 25 分間で 0 ～ 10% B、5 分間で 10 ～ 100% B。スペクトルは 260 ～ 640 nm で記録されました。定量化は、本物の F430 で構築された標準曲線に基づいて行われました (補足図 S1)。

精製した MCR サブユニットをプレキャスト 4 ～ 20% SDS-PAGE ゲル (Bio-Rad) で分離し、AcquaStain (Bulldog Bio) または Pierce™ Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) で染色しました。ゲル内トリプシン消化では、ゲルバンドを小片にスライスし、50% アセトニトリル/20 mM 重炭酸アンモニウム (約 pH 7.5 ～ 8) で 2 回洗浄しました。ゲル片を１００％のアセトニトリルを添加することによって脱水し、ＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥させた。ゲル片が溶液を完全に吸収するまで、さまざまな量のトリプシン溶液（20 mM 重炭酸アンモニウム中 0.01 μg μL-1）を加えました。サンプルを 37 °C で一晩インキュベートしました。トリプシンペプチドは、50% アセトニトリル/0.1% ギ酸で 2 回インキュベートすることによってゲル片から抽出されました。抽出物をSpeedVacで乾燥させた。同様のプロトコールをゲル内ペプシン消化に使用しました。ゲル片を５０％アセトニトリル／２０ｍＭ重炭酸アンモニウムですすいで脱色した後、ゲル片を０．１％ギ酸で２回リンスし、その後１００％アセトニトリルで脱水した。十分なペプシン溶液（Promega、0.04 M HCl中0.02 mg mL-1）を加えてゲル片を覆った。サンプルは 37 °C で一晩 (16 ～ 18 時間) 消化されました。ペプチドを５０％アセトニトリル水溶液で抽出した。溶液中トリプシン消化の場合、サンプルを 20 mM 重炭酸アンモニウムで 0.5 ～ 1 g L-1 に希釈し、最終濃度 10 mM でジチオスレイトールを補充しました。サンプルを 100 °C で 5 ～ 10 分間インキュベートし、室温まで放冷しました。次いで、タンパク質を、タンパク質対トリプシン（w/w）の比率50：1のトリプシンを用いて、37℃で一晩消化した。次いで、サンプルを真空乾燥させた。

タンパク質の同定のために、ゲルバンドのペプチド質量フィンガープリンティング (PMF) を Bruker Autoflex マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) 飛行時間型 (TOF) 質量分析計で分析しました。マトリックス化合物である 2,5 ジヒドロキシ安息香酸 (2,5-DHBA) を 50% メタノールに溶解して、約 10 g L-1 溶液を作成しました。約 0.5 ～ 1 μL のマトリックス溶液とサンプル溶液 (F430 およびトリプシンペプチド) を混合し、金属プレート上に置き、完全に乾燥させました。

PTM 分析およびキメラ MCR サブユニットの相対存在量の定量化のために、タンデム質量分析を備えた液体クロマトグラフィー (LC-MS/MS) 分析を、Proxeon Easy NanoLC システム (Waltham、Waltham) と組み合わせた Thermo Fisher LTQ Orbitrap Elite 質量分析計で実行しました。マ）。ペプチドを 0.1% ギ酸に再懸濁し、逆相カラム (200 Å 5 µM Bruker MagicAQ C18 樹脂を備えた自己充填カラム/エミッター) にロードし、質量分析計に直接溶出しました。簡単に説明すると、2 つの緩衝液勾配溶出 (緩衝液 A として 0.1% ギ酸、緩衝液 B として 0.1% ギ酸を含む 99.9% アセトニトリル) を 5% B で開始し、5% B で 2 分間保持し、その後 25% B まで増加しました。 60 分で B が 40%、10 分で B が 95% になります。データ依存取得 (DDA) 方法を使用して MS データを取得しました。最初にサーベイ MS スキャンが取得され、次に MS スキャンの上位 5 つのイオンが次の CID および HCD MS/MS 分析用に選択されました。 MS スキャンと MS/MS スキャンは両方とも、Orbitrap によってそれぞれ 120,000 と 30,000 の解像度で取得されました。データは、Xcalibur ソフトウェア (バージョン 2.2、Thermo Fisher Scientific) を使用して取得されました。タンパク質の同定と修飾の特徴付けは、Thermo Proteome Discoverer (バージョン 1.3/1.4/2.2) と Mascot (Matrix Science) または SEQUEST (Thermo) プログラムを使用して実行されました。修飾ペプチドのスペクトルをさらに検査して、割り当ての正確さを検証しました。相対存在量を定量化するために、同じ MCR サブユニットに属する同定されたペプチドのクロマトグラフィーのピーク面積が抽出され、結合されました。相対存在量は、組み合わせたピーク面積を直接比較することによって計算されました (補足データ 2)。

インタクトなタンパク質の質量分析のために、精製 MCR を 200 mM 酢酸アンモニウム (pH 7.6) 中で 10 μM の濃度で調製しました。スペクトルは、12 T Bruker Solarix FT-ICR-MS 装置を使用して取得しました。サンプルは、30μmの溶融シリカエミッターチップ（New Objective, Inc.）を備えたナノエレクトロスプレーを介して、300 nL min-1の流量で機器に導入されました。イオン光学系は、すべての RF 周波数を最低値 (8 極 2.0 MHz、衝突セル 1.4 MHz、転送 1.0 MHz) に設定し、3 ms の飛行時間を使用することで、高 m/z イオンの伝送用に最適化されました。スペクトルは、Bruker DataAnalysis の Savitzky-Golay フィルターを使用して平滑化されました。荷電状態の割り当てとデコンボリューションされた質量は、標準的な手法によって手動で決定されました。簡単に言うと、測定された各 m/z 比について、質量は質量 = (m/z)zz として計算されました。ここで、z は電荷です。複合体 I の場合、ピークは 28 ～ 32 の z に起因すると考えられます。複合体 II の場合、ピークは 28 ～ 31 の z に起因すると考えられます。報告された質量は各 m/z 比の値の平均となり、計算された質量の変動から標準偏差が計算されました。

プレキャスト 4 ～ 20% SDS-PAGE ゲル (Bio-Rad) でタンパク質を分離した後、それらをメタノール活性化ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。非特異的結合は、リン酸緩衝生理食塩水中の５％ミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を用いて室温で１．５時間ブロックした。次に、PVDF 膜を FLAG タグに対する一次抗体 (1:1000 希釈、カタログ番号 A8592、Sigma-Aldrich) とともに室温で 1.5 時間インキュベートし、PBST で 15 分間 3 回洗浄しました。次に、化学発光検出を強化するために西洋西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 基質を使用して PVDF 膜を開発しました (カタログ番号 32132、Thermo Fisher Scientific)。以前に報告されたように 47、各免疫反応性バンドの相対強度は ImageJ で推定され、使用された範囲にわたって線形応答が確認されました。

RNA 抽出と qRT-PCR は記載どおりに実行されました 47。プライマーは、Thermo Fisher Primer Express ソフトウェア v3.0.1 を使用し、融解温度 60 °C で、M. maripaludis mcrA および ANME-1_G37 mcrB 遺伝子の DNA 配列に基づいて設計されました。プライマー配列は次のとおりです: 5'-GTTCACCCTTCCCTTGCATG-3' (M. maripaludis mcrA-forward)。 5’-TGTTGATGGTCGATTAAGAATCTGCT-3’ (M. maripaludis mcrA-reverse); 5’-TCGTTAACCTGACCATTCGGA-3’ (G37 mcrB-フォワード); 5’-CCGCGGATTACCATTCCTTT-3’ (G37 mcrB-リバース)。標準曲線は、反応あたり 109 ～ 105 コピーの間で 10 倍段階希釈して作成しました。 qRT-PCR では、各 PCR 反応に 30 ng のトータル RNA を使用しました。すべてのサンプルは標準曲線内に収まり、増幅効率は 97%、R2 は 0.99 でした。

最適化された構造を得るために、改良された比較モデリング方法である RosettaCM が使用されました 48。 M. maripaludis MCR は、Methanopyrus kandleri (PDB コード 1E6V)、Methanosarcina barkeri (PDB コード 1E6Y)、Methanothermobacter thermaautotrophicus (PDB コード 1HBM)、Methanothermobacter marburgensis (PDB コード 3POT、5A8R)、Methanothermobacter wolfeii の MCR を使用してモデル化されました。 (PDB コード 5A8K 、５Ａ８Ｗ）、未培養古細菌（ＰＤＢコード３ＳＱＧ）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（ＰＤＢコード５Ｎ１Ｑ）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓｆｏｒｍｉｃｉｃｕｓ（ＰＤＢコード５Ｎ２８）、およびＭｅｔｈｅｒｍｉｃｏｃｃｕｓｓｈｅｎｇｌｉｅｎｓｉｓ（ＰＤＢコード７ＮＫＧ）をテンプレートとして使用した。 ANME-2_HR1 McrG のモデルは、Methanosarcina barkeri MCR (PDB コード 1E6Y)、Methanothermobacter thermaautotrophicus (PDB コード 1HBM)、Methanothermobacter marburgensis (PDB コード 3POT、5A8R)、Methanothermobacter wolfeii (PDB コード 5A8K、5A8) の MCR に基づいていました。 W)、テンプレートとして Methermicoccus shengliensis (PDB コード 7NKG) を使用します。ローカルドッキング検索は、RosettaDock (Rosetta バージョン 3.12)49,50 を使用して実行され、開始構造は、平行移動に 3 Å、回転に 8° のランダムなガウス摂動を使用して、事前にパックされた入力構造から生成されました ("-docking:dock_pert 3 8インチ）。デフォルトの回転異性体ライブラリーには、追加の chi1 および chi2 芳香族回転異性体 (「-ex1 -ex2aro」) が追加されました。チェーン ID によって定義されたドッキングパートナーにより、ANME McrG が M. maripaludis McrA、B、および A' の三量体の周囲に移動することが確認されました。 (「-ドッキング:パートナー ABD_C」)。各ドッキングランで約 60,000 個のモデルが製造されました (「-nstruct 60000」)。

Critical Assessment of Protein Interactions (CAPRI) の評価者によって定義されているように、ドッキング性能を測定するために、構造精度の多くの測定値が定期的に使用されています61。 I_rmsd は、同じ残基を重ね合わせた後の界面残基の重原子の二乗平均平方根偏差 (RMSD) として定義されます。ここで、界面は分子間距離が最大 8 Å のすべての残基として定義されます。ドッキング結果がドッキングファネルに到達したかどうかに基づいて分類しました。 CAPRI が定義した基準によれば、I_rmsd < 1.0 Å のモデルは高品質とみなされ、1.0 Å < I_rmsd < 2.0 Å は中品質とみなされ、2.0 Å < I_rmsd < 4.0 Å は許容可能な品質とみなされます。構造は PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System、バージョン 2.5、Schrödinger) で表示および調整されました。

各実験のサンプル数は、図の凡例と補足情報に記載されています。統計分析はGraphPad Prism 9ソフトウェアを使用して実行され、データは平均±標準偏差(SD)として表示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、論文および補足情報ファイル内で入手できます。原稿で使用された全長の切り取られていない元のウェスタンブロットとゲルを補足図S6に示します。相対存在量の定量化のための生の質量分析データは補足データ 2 に含まれています。図プロットのための生データは補足データ 3 に含まれています。この研究で使用されたプラスミドは、Addgene でアクセッションコード 192763、192764、192765、192766 でアクセスできます。、192767、192768、192769、192770、192771、192772、192773、192774、192775、192776、192777、192778。

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貴重な議論をしていただいた Steven Mansoorabadi (オーバーン大学) と、タンパク質質量分析の一部についてくださった Saw Kyin (Princeton Proteomics & Mass Spectrometry Facility) に感謝します。プラスミドの構築とバイオインフォマティクス分析は、ExxonMobil Research and Engineering Company から WBW および ECD への助成金によって支援され、精製タンパク質の特性評価は米国エネルギー省から WBW および ECD への助成金 (DE-SC0018028) によって支援されました。ネイティブ質量分析は、機器助成金 1S10 OD025118 によってサポートされました。 Thermo Orbitrap Elite と FT-ICR は、ジョージア大学のプロテオミクスおよび質量分析施設への助成金 S10RR028859 および S10OD025118 によってさらに支援されました。

ジョージア大学微生物学部、アテネ、ジョージア州、米国

ナナ・シャオ & ウィリアム・B・ホイットマン

EMTEC IT、エクソンモービルテクニカルコンピューティングカンパニー、米国ニュージャージー州アナンデール

ユ・ファン

ジョージア大学化学科、アテネ、ジョージア州、米国

チョウ・ウェン・チョウ、ロバート・V・ウィリアムズ、I・ジョナサン・アムスター

米国アラバマ州オーバーンのオーバーン大学化学生化学学部

シャディ・ヤヴァリ & エバート・C・ダイン

エネルギー科学、ExxonMobil Technology & Engineering Company、米国ニュージャージー州アナンデール

スチュアート・M・ブラウン & ユーチェン・リュー

生物医学科学、エクソンモービルテクノロジー & エンジニアリングカンパニー、米国ニュージャージー州アナンデール

イアン・J・ドレイク

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NS、YL、ECD、WBW が研究を企画しました。 NS は、遺伝学、タンパク質の精製および特性評価の実験を実施しました。 CWC はタンパク質質量分析のほとんどを実行しました。 YF と SMB は、バイオインフォマティクス分析とタンパク質構造モデリングを行いました。 SY は McrCmar プルダウン実験を実行しました。 RVWは、IJAIJDの研究室でインタクトタンパク質質量分析を実施し、qRT-PCR実験を実施しました。著者全員がデータを分析しました。 NS、YL、WBW が原稿を執筆し、著者全員が編集しました。

William B. Whitman または Yuchen Liu との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Alfred Spormann、Jennifer Glass、およびその他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Zhijuan Qiu と Eve Rogers。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Shao、N.、Fan、Y.、Chou、CW。他。未培養古細菌からの分岐メチル/アルキル補酵素 M レダクターゼの発現。 Commun Biol 5、1113 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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受信日: 2022 年 5 月 6 日

受理日: 2022 年 9 月 30 日

公開日: 2022 年 10 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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