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Aug 05, 2023

フラビンの酵素機能の進化

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 1042 (2023) この記事を引用

5244 アクセス

64 オルトメトリック

メトリクスの詳細

生物学における適応の分子機構の中で、酵素の機能の多様化は不可欠です。 生物がその触媒レパートリーを拡大し、根本的に異なる化学反応を採用できるようにすることで、動物は、新しい環境でさらされる新たに発見された物質や生体異物を利用したり排除したりすることができます。 ここでは、生体異物の解毒に不可欠なフラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMO) を調べます。 酵素学技術と組み合わせた古生物化学的アプローチを採用することで、我々は四足動物におけるファミリーの機能的多様化に関与する一連の歴史的置換を明らかにした。 注目すべきことに、いくつかのアミノ酸の置換により、酸素を供給するフラビン中間体を調節することにより、祖先のマルチタスク機能を持つFMOがより特化したモノオキシゲナーゼに分化します。 我々の発見は、酵素機能が活性部位コアに限定されない残基のサブセットに依存するという現在進行中の前提を裏付けるものである。

フラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMO) は、脊椎動物の解毒兵器の酵素および重要な資産です 1,2。 FMO は、ヘテロ原子を含む分子を水溶性で容易に排泄できる酸化物に変換する能力で一般に知られています 3。 より特異的なヘム含有シトクロム P450 モノオキシゲナーゼ 4 とは異なり、FMO は活性部位内に大量の基質を収容できます 5。 さらに、それらは抗炎症薬や抗がん剤の活性化における重要なステップを触媒し6,7、タウリンなどの必須物質の内因性合成にも関与しています8。 これらすべての酸化に対して、FMO は分子状酸素 (O2) と NADPH を水素化物供与体として使用します。 ヒトの FMO は疾患や障害と関連しており、FMO をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる最もよく知られた例として、一般に魚臭症候群として知られるトリメチルアミン尿があります 9,10。

ヒトゲノムは 5 つの FMO パラログ (FMO1 ～ 5) をコードしており、さらに 1 つは偽遺伝子 (FMO6) として記述されています11。 興味深いことに、この 5 つのパラログ配置は、事実上すべての四足動物で保存されています。 FMO 1 ～ 4 は、このファミリーについて説明されている標準反応である硫化物とアミン (以下、S/N またはヘテロ原子) の酸化を実行することにより、本質的に同じ触媒特性を共有します 8,12。 それどころか、FMO5 は長い間「疑似アクティブ」FMO13 であると考えられていました。 フィオレンティーニらが2016年に発表したのはつい最近のことだ。 らは、ヒト FMO5 が、ケトンとアルデヒドの C-C 結合に酸素原子を挿入することにより、根本的に異なる化学を実行できることを実証しました。この反応は、バイヤー・ビリガー (以下、BV) 酸化として知られています 14。 S/N 酸化と BV 酸化という 2 つの異なる化学反応は、共通の酸化反応性中間体である C4a-(ヒドロ)ペルオキシフラビンを介した異なる触媒機構によって達成されます。C4a-(ヒドロ)ペルオキシフラビンは、FMO 文献では「コックドガン」として定義されることがよくあります 15,16 (図. 1）。 S/N 酸化は、プロトン化されたフラビン中間体が電子豊富な基質を攻撃する共有求電子置換機構を介して機能します 15。 反対に、BV 反応では、C4a ペルオキシフラビンの脱プロトン化された形態が関与し、酸素化フラビン中間体と基質の間に四面体付加物 (クリージー中間体) が形成されます。 BV の酸素化では、触媒作用や炭素中心の移動中に形成される化学種に適応するために、活性部位に厳しい構造的事前調整が課せられます 17。 哺乳類のFMOの再構成に関する我々の以前の研究は、異なるS/NおよびBV化学が哺乳類においてすでに、そしておそらく各パラログクレードの出現時に定義されていることを示唆しており、2つのFMO品種の存在を示唆しており、1つはS/N専用である。酸化 (FMO1-4) と BV 酸化 (FMO5) 18,19。

繰り返される分子構造は、FAD 補因子のイソアロキサジン部分を表しており、R はリビチル アデノシン尾部に対応します。 Eは酵素の略です。 まず、酸化されたFAD（E-FAD）はNADPHによって還元されます。 還元型酵素 (E-FADH2) は O2 と容易に反応し、酸素化酵素中間体 C4a-フラビン(ヒドロ)ペルオキシド (E-FADOO(H)) を形成します。 ここから、S/N 酸化または BV 酸化という 2 つのメカニズムが考えられます。どちらも、その後に H2O と NADP+ が放出されます。 基質が存在しない場合、酵素は脱共役と呼ばれる無駄な過酸化水素生成サイクルを経ます。

生化学および生物物理学の方法論と組み合わせた祖先配列再構築 (ASR) は、タンパク質機能の歴史的および物理的原因を明らかにするための強力な戦略であることが証明されています 20,21。 有害物質や有毒物質に対処するための戦略を進化させることは、あらゆる形態の生命の生存にとって極めて重要です。 この原則に基づいて構築することで、テトラポッド FMO は進化に伴って酵素の機能がどのように多様化するか (つまり、S/N 対 BV 酸化) を学ぶための洞察力に富んだケーススタディになると考えました。 FMO は触媒的に複雑な酵素です。 触媒作用は、補欠分子族 (FAD)、共基質 (酸素分子)、電子供与体 (NADPH)、基質、およびタンパク質マトリックスに依存します (図 1)。 この研究では、これらの多くの触媒アクターの相互作用を集合的に微調整する歴史的な置き換えを追跡します 22,23。 FMO の場合、機能的多様性は活性部位の外側の残基のネットワークによって引き起こされ、酸化フラビン中間体の形成を調節します。

脊椎動物 FMO の進化の歴史は、すべての陸生脊椎動物および硬骨魚からの配列を外部グループとして含む代表的なデータセットを使用する最尤法およびベイジアン法によって推論されました（補足図 1 および 2）。 FMO は、初期の有顎脊椎動物の単一コピー配列から、哺乳類やその他の主要なクラスの動物の 5/6 個のパラログ配列に進化しました。 以前に報告したように、このパラログのバーストは四足動物の出現と同時に発生します18。 mAncFMO18および現存するFMO24の機能プロファイルを考慮して、クレードの活性が予測されました（図2a）。 これは、すべての四足動物 FMO の共通祖先から現存するパラログまで、機能的に分岐する 2 つの軌跡が存在することを証明しました。 機能の相違、S/N 対 BV 酸化を説明する 3 つの同様に倹約的な仮説が考えられます。 まず、四足動物の祖先はヘテロ原子に酸素を供給することしかできず、BV 酸化を実行する能力が FMO5 クレード内で出現しました。 演繹的に、これは FMO の正規の活動を考慮した最も可能性の高いシナリオです25。 あるいは、四足動物の祖先は両方の活動を持ち合わせており、複製事象の後、時間の経過とともに酵素が特殊化したとも考えられます。 最後に、四足動物の祖先は BV 酸化のみを行うことができ、複製イベントの後、S/N 酸素化を可能にする変化が FMO1-4 系統に導入されました。

a ノードに標的祖先を持つ有顎脊椎動物からの FMO の系統発生の崩壊: (1) tAncFMO1-5、(2) tAncFMO5、(3) tAncFMO1-4、および (4) tAncFMO1-3 (黄色の円)。 クレードは哺乳類の祖先の活性に基づいて色分けされています: S/N 酸化 (青)、BV 酸化 (オレンジ)。 FMO4 活性の実験による確認は得られていません。 描かれたシルエットは、祖先の四足動物 (CC BY-SA 3.0 に基づく Dmitry Bogdanov による (T. Michael Keesey によるベクトル化)) とアクチノプテリギ (条鰭の魚) を表しています。 スケールバーは部位ごとの置換を表します。 b NADPH (赤線、KM = 15.7 ± 1.8 μM) および NADH (青線、KM = 90 ± 17.6 μM) に対する tAncFMO1-4 の定常状態動態。 メチル-p-トリルスルフィド(MPTS)を基質として使用した。 観察された速度は、340 nm での吸光度変化を追跡することによって得られました。 データは平均値として表示され、エラーバーはSDに対応します（n = 3回の独立した実験）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 c S/N および BV 酸化活性をテストするための 3 セットの基質を使用した変換アッセイ。 哺乳類の祖先 FMO (mAncFMO18、19) が分析に含まれました。 棒は平均変換値を表し、点は各実験の値を表します (n = 2 の独立した実験)。 S/N 酸化は青色で示され、BV 酸化はオレンジ色で示されます。 ソースデータは補足表 4 に示されています。

機能分岐への道筋を理解することを目的として、家族拡大の前後に祖先を復活させることにしました。 実験的特性評価の対象となったのは、tAncFMO1-5、tAncFMO5、tAncFMO1-4、および tAncFMO1-3 の 4 つのノードです (図 2a)。 すべての祖先は同じ長さ（532アミノ酸）であると決定され、高い信頼度で再構築されました（全体の事後確率（\(\overline{{PP}}\)）> 0.94）（補足図3）。 tAncFMO1-5 (\(\overline{{PP}}\) = 0.95) は最初の複製イベントより前の祖先 (すべての四足動物 FMO パラログを含む) ですが、tAncFMO5 (\(\overline{{PP}}\) = 0.96 ) と tAncFMO1–4 (\(\overline{{PP}}\) = 0.94) はその娘パラログであり、機能的に多様な各系統の祖先です。 FMO1–4 クレード内ではさらに重複イベントが発生し、その最初のものが FMO4 クレードと tAcFMO1–3 (\(\overline{{PP}}\) = 0.95) を生み出し、これも復活しました。 この祖先 (tAncFMO1-3) から、次に FMO2 グループが出現し、続いて FMO1 と FMO3 が出現し、後者は哺乳類のみでさらに複製されて、ヒトの偽遺伝子である FMO6 が生じました 21。 ASR の目的は、正確な配列ではなく、絶滅した分子の表現型を回復することであるため、再構築における不確実性を考慮する必要があります 26。 したがって、代替祖先シーケンス (Alt_tAncFMO) も取得されました。 これらは、曖昧に再構築されたすべてのサイトでの 2 番目に良い状態の組み合わせを表示します 27 (「方法」を参照)。

選択されたすべてのノードは膜結合タンパク質として発現でき、精製するとフラビン含有酵素の典型的なスペクトル特性を示しました（補足図4）。 祖先は、哺乳類の AncFMO に匹敵する非常に優れた熱安定性 (\(\bar{{T}_{m}}\) \(\sim\) 60 °C、補足表 1) を示しました。 ただし、この場合、酸化型補酵素 NAD(P)+ の存在は Tm 値に影響を与えませんでした。 まず、復活した tAncFMO が、典型的な四足動物 FMO に期待される速度論的特徴を示したことを確認しました。 たとえば、tAncFMO1〜4は、モデル基質メチル-p-トリルスルフィドに対して典型的なミカエリス・メンテン挙動（触媒効率（kcat/KM）= 0.98 s-1 mM-1;補足図5）と、 NADH に対する水素化物供与体としての NADPH (図 2b)。 それらの O2 親和性 (KMO2) は低マイクロモル範囲にあることがわかり、酸素を効率的に使用できることを示唆しています (補足図 6、補足表 2)。 さらに、復活した酵素は、脱共役反応において電子供与体として NADPH および NADH を消費する可能性がありますが (補足図 7、補足表 2)、NADH 対 NADPH を使用した場合、有意に低い酸素化が達成されました (例: tAncFMO1–4 + NADH = 15)。 % 基質変換、tAncFMO1–4 + NADPH = 100% 変換;補足図 8)。 この補酵素依存性は、抗酸化細胞防御システムにおける NADPH の優位性と一致しており 28、ニコチンアミド補因子の正体が酵素の機能を定義する上で極めて重要な役割を果たしていることが実証されています。 次に、プロトタイプ基質のパネルを使用してそれらの触媒挙動を評価し、S / NおよびBV酸化を実行する能力をスクリーニングしました（図2c、補足図9および10、補足表3および4）。 各系統の祖先がその子孫と同じ活動をしていることが観察されました。 具体的には、tAncFMO1-4 および tAncFMO1-3 はもっぱら S/N 酸化を実行しましたが、tAncFMO5 は、ヘテロ原子含有基質を部分的に変換するか変換せずに、テストした 3 つすべてのケトンの BV 酸化を触媒しました。 対照的に、複製前の祖先 tAncFMO1-5 は 3 種類の基質すべてを酸化し、S/N および BV 酸素化酵素として活性であることが判明しました。 再構成の堅牢性を検証するために、代替祖先も復活させました (補足表 5)。 それらはすべて、それぞれの tAncFMO と同じ表現型を示しました (補足表 4)。 これらの発見は、すべての四足動物の FMO パラログ (tAncFMO1 ～ 5) の祖先は、BV 酸化と S/N 酸化の両方を実行できる二機能性酵素であったという重要な結論につながりました。

配列空間におけるフィットネスランドスケープの観点からは、tAncFMO1〜5の複数の触媒活性は、BVおよびS/N酸化活性に対応する2つの重複するピークとして解釈できます（図3a）。 娘パラログである tAncFMO1 ～ 4 は、BV 酸化を実行する能力を失った後も単一のピークを保持しました。 BV 対 S/N 機能の配列決定因子を分析するために、tAncFMO1 ～ 4 の歴史的な置換の一部を元に戻して BV 酸化活性を再インストールする変異戦略が設計されました。 tAncFMO1-5およびtAncFMO1-4の構造モデルは、mAncFMO5（PDB：6SEK）をテンプレートとして使用するYASARA29とAlphaFold230を使用した相同モデリングによって構築されました（補足図11）。 両方の祖先を接続する分岐で 45 の置換が発生したことを考慮して、(i) 再構成における考慮された部位の MAP (最大事後) 状態の確率、(ii) 保存の程度に基づいて「復帰」変異を特定しました。ヘテロ原子酸素生成 FMO の複数配列アラインメント、および (iii) それらの構造位置。 分析の最初のラウンドでは、活性部位、基質/生成物トンネル、FADの近傍、およびNADPH周囲の最初または2番目の残基シェルに存在する4、12、および16個の置換を有するtAncFMO1-4変異体を調製した（図1）。 .3b、補足図12)。 16x および 12x 変異体は、BV 基質フェニルアセトンに対して低い活性を示しました。 それでも、4x変異体はtAncFMO1-4と同じ触媒プロファイルを示しました（図3c）。 したがって、12x 変異体から始まる 4 置換の別のサブセットは、FMO5 系統に見られる残基の厳密な保存と、特定のアミノ酸が水素結合相互作用に関与しているかどうかに焦点を当てて設計されました。 4'Xと名付けられたこの変異体は、S/N酸化に対する活性を維持しながら、少量ではあるが依然としてかなりの量でBV酸化を触媒することができた。 次に、BV 酸化が起こるためにこれらの置換のどれが必要であるかを分析するために、単一、二重、および三重の変異体をテストしました (図 3d)。 I60、H275、および H426 間のプラスの相乗効果は、それぞれの単一変異体が専ら S/N 酸化を触媒する一方、ケトン酸化はこれら 3 つの置換を組み合わせた場合にのみ回復することから明らかになりました。 さらに、4 番目の置換 (N222) は、これを含めると BV 酸化の変換率が低下するため、有害な役割を果たしていると考えられます。 興味深いことに、I60 のみが活性サイト内に位置しています。 その疎水性側鎖は、基質結合ポケットの後ろ、イソアロキサジン環の si 面のすぐ近くに押し込まれています (図 4)。 H275とH426は代わりに、補酵素NADP+から3〜7Å離れたタンパク質の周囲に向かっています（図4b、c）。 おそらく、これらの2つの残基は、その結合ポケット内のジヌクレオチドと、表面に結合した水分子を介した水素結合ネットワークに関与していると思われます（図4d、e）。 この構造的洞察から、3x-tAncFMO1-4 の BV 酸化活性に関与する相互作用ネットワークは、NADP+ および FAD 補因子との共役相互作用を介して媒介されることが明らかであると思われます。 この種の相互作用は、リガンドによって中継されるエピスタシスとして分類されており、酵素機能のために確立される最も複雑な置換ネットワークであると考えられています 31。

配列空間におけるランドスケープとしての機能の観点から復帰突然変異戦略を描いたスキーム23。 b 構築された各バリアントで変異した部位のリスト。 後続の突然変異ラウンドはグレースケールで表されます。 c tAncFMO1–4 変異体によって触媒される変換、および d 4'×-tAncFMO1–4 の分析。 棒は平均変換値を表し、点は各実験の値を表します (n = 2 の独立した実験)。 ソースデータは補足表 4 に示されています。

a 4'x (I60T、N222S、H275N、H426N) 残基を含む tAncFMO1-4 のモデルを緑色で示します。 b、c 4'×残基が標識された焦点を絞った図。 I60 側鎖の Cγ1 の H と FAD の C4 の O の間の距離 (2.6 Å)、および NADP+ のリン酸部分の 2 つの O 原子を含む H275 の Nε2 と H426 の Cε1 の間の距離 (6.7 Å) 3.3 Å）をそれぞれ示します。 d I60 の水素結合相互作用は水色で示されています。 e H275 と H426 の水素結合相互作用は水色で示されています。 tAncFMO1-5 の二次構造と残基は紫色で示されています。 FAD 分子と NADP+ 分子は、それぞれ黄色と青色で示されています。

突然変異解析の結果は、四足動物 FMO の機能的特殊化の機構的基盤に関する疑問を引き起こしました。 これに対処するには、まずこれらの酵素の特徴、つまり NADPH が果たす二重の役割に注目する必要があります。 この補因子はまずフラビンを還元し、次に立体構造変化を受けて、そのカルバミド基をフラビンの N5 原子からの水素結合距離内に配置します。 この立体構造では、NADP+ は、還元型フラビンと分子状酸素の反応によるフラビン-(ヒドロ)過酸化物の形成を決定的に促進します。 したがって、NADPH は電子供与体であると同時に、基質の酸素化が起こるために不可欠な不可欠な触媒元素でもあります。 このようなメカニズムの背景を考慮して、我々はまず、tAncFMO1-5 および tAncFMO1-4 の NADPH との反応性を調べることを目的としました。 迅速な反応速度分析を使用して、両方の酵素が嫌気条件下でNADPHによって還元されることがわかりました（tAncFMO1〜5の場合はkred = 0.0097 ± 1.2 × 10−4 s−1、tAncFMO1〜4の場合は0.25 ± 0.016 s−1）（補足図。 13)。 次に、嫌気的に NADPH を減少させた FMO を使用して、O2 (0.62 mM) と酵素の反応性を研究しました。 tAncFMO1-5 と tAncFMO1-4 はどちらも、典型的な 2 段階のプロセスで同様の速度 (tAncFMO1-5 では kox = 1.5 ± 0.1 s-1、tAncFMO1-4 では 3.2 ± 0.11 s-1) で酸素と反応しました。このステップにより、C4a-(ヒドロ)ペルオキシフラビンについて提案されたスペクトル特性と一致するスペクトル特性を持つ種が得られました（λmax = 380 nm）32（図5、補足図14）。

ストップフロー装置で還元型 tAncFMO1-4 と分子状酸素の反応をモニタリングするためにスペクトルをタイムリーに記録しました。 代表的なものを示します (n = 3 の独立した実験)。 左上の挿入図は、2 段階のプロセス \(a\mathop{\to }\limits^{{k}_{1}}b\mathop{\to }\limits^{{k}) に当てはめられたデコンボリューションされたスペクトルを示しています。 _{2}}c\)、k1 = 3.2 ± 0.11 s−1 および k2 = 0.0065 ± 0.0001 s−1。 右上の挿入図は、種 a (E-FADH2) と種 b (E-FADOO(H)) の間の吸光度の変化を示しています。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

機構的に重要な問題は、反応性中間体のプロトン化状態に関するものであり、プロトン化された形態は主に S/N 酸化に起因し、脱プロトン化された形態は代わりに BV 酸化をもたらすと考えられています 17。 シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼに関するマッシーのグループによる先駆的な研究は、脱プロトン化により吸収ピークのブルーシフトが生じるため、脱プロトン化されたフラビン-(ヒドロ)ペルオキシドとプロトン化されたフラビン-(ヒドロ)ペルオキシドのスペクトルが異なる可能性があることを示しました。 ストップフロー実験では、tAncFMO1-5とtAncFMO1-4の中間スペクトルに明確な違いは示されませんでした（図5、補足図14）。 したがって、フラビン-(ヒドロ)過酸化物スペクトルにおけるプロトン化によって誘発される変化は、酵素特異的であるか、および/または小さすぎてこれらの酵素では測定できない可能性があります。 両方の祖先間の機能的多様性は、中間プロトン化だけでなく他の要因からもたらされる可能性もあります。 フラビン-(ヒドロ)ペルオキシドの pKa を約 8 と仮定すると 33,34、酵素集団は部分的にプロトン化され、部分的に脱プロトン化され、我々のアッセイ条件で S/N 酸化と BV 酸化の両方が可能となる可能性があります。 tAncFMO1-5 と tAncFMO5 は確かに両方の反応が可能です (図 2c)。

手がかりは、T60I、N275H、N426H の三重変異体によって提供され、tAncFMO1 ～ 4 の BV 活性を回復します。 この変異体の実験的特徴付けでは、tAncFMO1-4と同様のスペクトル特徴と速度論的挙動を示しました（補足図15および16）。 これらの変異はどれも単独では BV 機能をインストールするには十分ではなく、代わりに 3 つすべてが同時に存在する必要があります。 H275 および H426 は、NADP+ を囲む第 1 および第 2 シェル残基に正に帯電した部位を導入します。 I60は、フラビンN5およびNADP+の近くのカルバミド基の上にぶら下がっている厳密に保存された必須残基であるN61に物理的に近い35、36（補足図17）。 したがって、これらの残基の組み合わせは、触媒中心の周囲の静電気をわずかに乱し、強く結合した触媒的に必須の NADP+ の局所的なダイナミクスを微調整する可能性があります。 その結果、T60I、N275H、および N426H 変異は、負に帯電した Criegee 中間体の形成を静電的に促進し、活性部位に炭素原子の移動に必要な適応性を与えることで、BV 触媒作用を可能にする可能性があります。

この研究では、歴史的アプローチを採用することにより、動物 FMO における触媒作用の出現と発展に光を当てました。 四足動物における FMO ファミリーの軌跡を機能的に解剖しました。 結果として、議論すべき 2 つの注目すべき側面があります。 1 つはヌクレオチド依存性酵素の触媒に関するもので、もう 1 つは生物の生物学に関連したものです。

FMO は、いくつかの触媒要素の正確に調整された作用によって選択的酸素化を触媒する酵素です。 水素化物供与体 (NADPH) は、触媒サイクル全体にわたって結合したままであり、その放出が触媒作用の速度を決定することが多いため、重要な役割を果たすことが長い間知られてきました 33。 しかし、酸素化反応の種類における水素化物ドナーの影響の構造的基盤は不明のままです。 同様に、FMO ファミリーに対して定義される典型的な反応は、ヘテロ原子を含む分子の酸化です 11。 ヒト FMO5 が BV 酸化を実行することが証明されたという事実は、間違いなく、この酵素ファミリーの理解におけるパラダイムシフトでした 14。 祖先配列再構築と酵素学技術を主なアプローチとして使用して、有顎脊椎動物における FMO の進化経路を探索することにより、FMO の触媒作用のこれら 2 つの興味深い側面を理解することができました。 FMO は、ヌクレオチド補因子である FAD および NADP+ によって媒介される活性部位の遠位置換間のエピスタティック相互作用を介して、S/N 酸化と BV 酸化という 2 つの基本的に異なる化学反応を実行します。 これら 2 つの酵素機能の配列決定基は相互に排他的ではなく、多機能祖先 FMO (tAncFMO1-5) で実証されているように、両方が同じタンパク質コア内に共存できるためです。 これは、BV 活性がタンパク質ファミリーの標準的なものであると考える可能性を高めます。 他の分類群からのより多くの FMO が体系的に哺乳類 FMO として特徴付けられるまで、それはまだ決定されていません 8、14、18、19、37、38。 したがって、2 つの基本的な結論を概説することができます: (i) ヌクレオチド依存性モノオキシゲナーゼの場合、機能は内部触媒ネットワーク、水素化物供与体の正体および基質/O2 ペアを設定する機能置換間の複雑な相互作用の結果です。 ii) 酵素の特殊化は、触媒残基を直接標的とするのではなく、酵素の相互作用と構造動態の微妙なバランスを変える、ありそうもない突然変異によって起こる可能性があります。

生物の生物学的側面に関して、我々の分析により、現存するすべての四足動物 FMO は、BV とヘテロ原子の一酸素化の両方を行う祖先酵素から進化したことが明らかになりました。 したがって、この発見は、BV 活性が過去において生存に不可欠であった可能性があり、それが新機能化事象の結果ではないことを示唆しています。 現代の FMO パラログで観察された機能的分岐は、革新-増幅-分岐 (IAD) モデルに沿った、遺伝子重複による機能最適化プロセスの結果です 39。 最初の複製事象の後、FMO5 系統は複製前の祖先の酵素機能を保存し、BV 酸化活性は現生種でも持続します 14。 FMO1-4 系統は、ヘテロ原子含有分子の酸素化に向けて機能的に最適化されており、連続する遺伝子重複によって特殊化されています。 我々は、骨性脊椎動物から四足動物への移行には、FMO ファミリーの拡大と多様化のきっかけとなった環境課題 40 (食事、陸上植物との共存、高濃度の O2 への曝露など) が関与していたと仮説を立てています。 FMO は植物の代謝産物をより毒性の低い物質に変換できるため、CYP について提案されたアイデアを反映して、同様のアイデアが過去に漠然と推測されました 41。 この仮説は、硬骨魚には単一コピーの FMO しか存在しないことによって裏付けられています。 FMO は時間の経過とともに数が増加し、機能的に多様化し、ヘテロ原子とカルボニルを含む化合物を変換できる非常に汎用性の高い解毒システムを四足動物に与えました。

四足動物の FMO 系統は、以前に報告されたデータセットをソースとして使用して構築されました18。 データセットは次のように強化されました：（i）以前に実験的に特徴付けられたホモサピエンスのFMO配列は、GenBankの非重複タンパク質配列（nr）およびUniprot KBのBLASTp検索のクエリとして使用されました。 検索は、TimeTree 知識データベース 43 に基づいて、陸生脊椎動物 (つまり、両生類、鳥類、鰐目、鱗竜目、哺乳類の綱とヒツジ目) に含まれる FMO の多様性全体をマイニングすることを目的とした綱または目による生物の分類によって制限されました。 根の配列を収集するために、Actinopterygii、Cladistia、および Chondrichthyes などの硬骨魚のグループも採掘されました。 (ii) 部分配列または低品質配列 (NCBI44 で定義) は除外されました。 (iii) 収集されたすべての配列を収集し、MAFFT v745 を使用して多重配列アラインメント (MSA) で分析し、複数回収集された配列を除去しました。 真の ORF に対応する配列はデータセット内に保持されました (必要な場合、これは相互の tBLASTn 検索によって確認されました)。 このプロセスにより、代表的な非冗長データセットが確実に構築されました。 これには、両生類、哺乳類、鳥類、爬虫類、精巣類、硬骨魚類のそれぞれ 35、272、77、55、31、および 66 の FMO ホモログが含まれていました。 MSA には 536 の配列 (613 部位) が含まれており、単一配列の拡張 (537 部位) のために手動でトリミングされました (補足データ 1)。 最適モデル パラメーター (JTT 置換行列および α = 1.114) は、ProtTest v3.446 の Akaike 情報量基準によって取得されました。 系統発生は、RAxML v8.2.10 (HPC-PTHREADS モジュール) の最尤法によって推定されました 47。 トポロジーの堅牢性は、500 回のノンパラメトリック ブートストラップを実行することによって評価され、これらは後に BOOSTER48 で転送ブートストラップ期待値 (TBE) の対象となりました。 また、系統発生は、収束 <0.2 (分割周波数の標準偏差によって決定) に達するまで、2,000,000 世代を実行して Mr. Bayes v3.2.649 で推定されました。 Figtree v1.4.2 を使用してツリーを視覚化し、編集しました。 祖先配列の再構成は、CODEML モジュール 50 を使用したマージナル再構成として PAMLX v.4.9 で実行されました。 経験的置換行列、経験的平衡アミノ酸頻度 (モデル = 3)、4 つのガンマ カテゴリ (α = 1.114)、およびジョーンズ置換行列を使用して配列を分析しました。 各部位の祖先状態の事後確率分布は、tAncFMO1-5、tAncFMO5、tAncFMO1-4、および tAncFMO1-3 に対応するノードで分析されました。 祖先の長さは、各クレードの派生配列の長さに基づいて、ターゲットノードのギャップの有無を分析する節約によって処理されました (Fitch のアルゴリズム) 26。 代替状態が事後確率 (PP) > 0.2 を示した場合、サイトは曖昧に再構成されたと見なされます。 代替祖先のシーケンス (Alt_tAncFMO) は、曖昧に再構築されたサイトの 2 番目に良い状態と MAP 状態 (PP > 0.8) をすべて含めることによって生成されました。

変異体の設計は、(i) 部位ごとの再構築の精度、(ii) 各部位の保存度、および (iii) 各部位の構造環境という 3 つの主要な要素を含むバイオインフォマティクス分析に基づいています。 まず、tAncFMO1-5 と tAncFMO1-4 を接続する分岐の 45 個の置換をリスト化し、再構成時にそれらの PP を検査しました。 両方のノードで PP > 0.8 を表示したものは、真の置換とみなされ、次のステップに選択されました。 また、ノードの 1 つで検査されたサイトが PP < 0.8 で再構成され、代替状態 (PP > 0.2) が他のノードの MAP 状態と異なる場合、それが選択に含まれました。 この最初のプロセスにより、検査する置換の数を 27 に減らすことができました。その後、選択した各サイトの保存度が ConSurf サーバー 51 を使用して分析されました。 データセット全体にわたって、またはヘテロ原子酸化系統または BV 系統の間で保存されていると特定された部位がさらに選択されました。 最後に、BV 系統のモデルとして mAncFMO5 (PDB 6SEK)、ヘテロ原子酸化系統のモデルとして mAncFMO2 (PDB 6SF0) の構造を使用して、各部位の構造環境を検査しました。 実験的にテストする候補として 16 のサイトが検出されました。 これらの部位は、活性部位への近さおよび/または保存度に応じてさらに 3 つのサブグループに分類されます。 したがって、4X には活性部位の 4 つの置換が含まれ、12X には 4X と 8 部位の置換が含まれ、16X には選択されたすべての部位が含まれます。

tAncFMO1-5 および tAncFMO1-4 の三次元構造は、Casp14/full_dbs 設定を使用して AlphaFold230 を使用してモデル化されました。 また、YASARA29と6SEKをテンプレートとして構造モデルを取得しました。 これらには、活性部位に FAD および NADPH 補因子が含まれていました。 構造は、ChimeraX 1.2.5 および PyMOL 2.5.2 で検査されました。 バイヤー・ビリガー酸化の導入に有益となる可能性のある突然変異を合理化するため。 残基は、それらがFADおよびNADPH結合ドメインに存在するか、または基質トンネル形成の基本であることが以前に示されている80残基挿入に存在するかに応じて、3つのグループに分類された。 分類されると、残基は「表面」ま​​たは「コア」のいずれかに割り当てられました（補足図12）。 このステップは、機能の変化に何の役割も果たさなかった可能性のある残留物を迅速に除去するのに役立ちました。 残りの残基はすべて保持され、前述の復帰突然変異戦略を使用して評価されました。

大腸菌 NEB10β 細胞 (カタログ番号 C3019I)、DpnI (カタログ番号 R0176L)、および BsaI-HF V2 (カタログ番号 R3733S) は New England Biolabs から入手しました。 T4 DNA リガーゼ (カタログ番号 EL0013) は Thermo Fisher Scientific に注文しました。 NADPH (カタログ番号 44335000) は Oriental Yeast Co. から注文しました。タモキシフェン N-オキシド (カタログ番号 FT27997) とベンジダミン N-オキシド (カタログ番号 FB18263) は Biosynth から購入し、他のすべての化学物質は Sigma-Aldrich から購入しました。

5 ' 末端と 3 ' 末端の両方に BsaI 制限部位を含む合成遺伝子は、tAncFMO: 1 ～ 3、1 ～ 4、1 ～ 5、5、および 4x については、Twist Bioscience または Integrated DNA Technology (IDT) から注文されました。 、４×'、１２×、および１６×のバリアントをそれぞれ含む。 凍結乾燥した遺伝子を、滅菌10 mM Tris-HCl、pH 8.0中に最終濃度10 ng μl-1になるように再懸濁した。 すべての tAncFMO 遺伝子は、Golden Gate クローニング法に従ってクローニングされました。 レシピエントベクターは、標的タンパク質がそのN末端でN-6xHis-tag-SUMOタンパク質に融合して発現されるように修飾されたpBADプラスミドでした。 クローニング混合物は以下の通りでした: 55.4 ngのtAncFMOインサート、75 ngのGolden Gateエントリーベクター(2:1のインサート:ベクターのモル比)、15 U BsaI-HF V2、15 U T4 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼバッファー(1×)、ヌクレアーゼフリー水を加えて最終容量を20μlとした。 ネガティブコントロールはインサートを含まずに調製され、PCR サイクルは次のとおりです。最初のステップは 37 °C で 1 時間、その後は 55 °C で 10 分間のサイクルです。 次に、温度を 65 °C に 20 分間設定し、8 °C に保持しました。 クローン化したら、pBAD-6xHis-SUMO-tAncFMO プラスミドを CaCl2 コンピテント大腸菌 NEB10β 細胞に形質転換しました。 5.0μlのプラスミドDNAを100μlのCaCl2コンピテントセルに添加し、30分間インキュベートした。 次いで、細胞に42℃で30秒間熱ショックを与え、氷上で5分間インキュベートした。 500μlのLB-SOCを添加して、細胞を37℃で1時間回復させた。 次いで、再懸濁した細胞ペレットを、100μg ml-1のアンピシリンを含むLB寒天上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。 プラスミドを精製し、配列決定によって検証しました。 20 パーセントのグリセロール ストックは -70 °C で保存されました。

4 ml LB-amp (50 μg ml-1) の事前接種材料を 37 °C で一晩増殖させ、50 mg l-1 アンピシリンと37℃でインキュベートしました。 OD600 が 0.2 ～ 0.5 の場合、滅菌 20% ストック (w/v) から 0.02% L-アラビノースを添加することによって発現を誘導しました。 培養物は、収穫前に合計 30 時間振盪しながら 24 °C で増殖させました。 細胞を遠心分離(2755g、25分)により回収した。 ペレットを緩衝液 A (250 mM NaCl、50 mM リン酸カリウム、pH 7.5) に 5:1 の比 [体積 (ml): 質量 (g)] で再懸濁し、0.10 mM フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび 1.0 mM β-メルカプトエタノール。 細胞の破壊は、超音波処理（70％振幅、5秒間オン、5秒間オフ、合計20分間）によって行った。 19,500gで20分間遠心分離した後、上清を除去し、ペレットを緩衝液A2（250 mM NaCl、50 mM リン酸カリウム、0.5% TritonTm X-100還元、pH 7.5）に再懸濁しました（TritonTm X-100還元、Cat # X100RS-25G、Sigma-Aldrich) を以前と同じ比率 (5:1) で使用します。 再懸濁したペレットを4℃で一晩混合して膜タンパク質を可溶化し、19,500gで遠心分離して上清を回収しました。 tAncFMO は、金属イオン アフィニティー クロマトグラフィー樹脂 (カタログ番号 17-5318-02、Cytiva) を使用して精製しました。 無細胞抽出物をカラムに適用し、イミダゾールの濃度を増加させて洗浄した。 緩衝液Ｂは（２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸カリウム、３００ｍＭのイミダゾール、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００還元、ｐＨ７．５）を含んでいた。 0、25、および50 mMイミダゾールでの洗浄ステップに続いて、タンパク質は最後に300 mMイミダゾールで溶出されました。 HiPrep 26/10 Desalting カラム (カタログ番号 17-0851-01、Cytiva) を使用して、溶出バッファーを保存バッファー (250 mM NaCl、50 mM リン酸カリウム、0.05% TritonTm X-100 還元、pH 7.5) と交換しました。 。

精製した 6xHis-SUMO タグ付き酵素を液体窒素で凍結し、-70 °C で保存しました。 これらのアリコートを使用して実験を実行しました。 tAncFMO の濃度は、室温で解凍し、その後 95 °C でインキュベートし、遠心分離し、上清を Jasco V-660 分光光度計で分析した凍結サンプルから測定しました。 450 nm で εFAD = 11.3 mM-1 cm-1 を使用してホロ酵素の量を定量化し、他のそれぞれのアリコートについても同じであるとみなしました。

部位特異的突然変異誘発のために、10 µM プライマー、フォワードおよびリバース、100 ng のテンプレート DNA、1.6% DMSO、0.8 mM MgCl2、および 1× Pfu Ultra II Hotstart Master Mix (カタログ番号 600850、アジレント）。 Quick Change PCR サイクルは、次の方法を使用して実行されました。最初に 95 °C で 5 分間インキュベートし、次にサイクル (95 °C で 5 分間、60 °C で 30 秒間、72 °C で 6 分間) を 25 回繰り返しました。 ; 続いて 72 °C で 10 分間加熱し、8 °C で保持して終了します。 PCR混合物をDpnIで一晩消化し、大腸菌CaCl2コンピテント細胞に形質転換した。 その後の突然変異は、以前に得られた突然変異体を使用して行われました。 以下のプライマーを使用しました: T60I Fw 5'-GCGCGCATCAATCTATAAAAGTGTAATTATAAACACGAGCAAAGAG-3'

& Rv 5'-CTCTTTGCTCGTGTTTATAATTACACTTTTATAGATTGATGCGCGC-3';

N222S Fw 5'-GGGAAGCTGGGTCCTGAATCGGGTATCG-3' &

Rv 5'-CGATACCCGATTCAGGACCCAGCTTCCC-3';

N275H Fw 5'-CTACGGATTAGTGCCTCAACATAGAATCCTTTCCCAACA-3'

& Rv 5'-TGTTGGGAAAGGATTCTATGTTGAGGCACTAATCCGTAG-3';

N462H Fw 5'-GGTTTGTTACGAGTCAGCGTCATACCATTCAAACGGATTAT-3' &

Rv 5'-ATAATCCGTTTGAATGGTATGACGCTGACTCGTAACAAACC-3'

S の酸化活性を評価するために、芳香族チオエーテルであるメチル-p-トリル スルフィド スルフィド (カタログ番号 275956-5G、Sigma-Aldrich) と嵩高いベンジル フェニル スルフィド (カタログ番号 8415660025、Sigma-Aldrich) をテストしました 52,53。 N 酸化活性については、ベンジダミン (カタログ番号 B5524-5G、Sigma-Aldrich) およびタモキシフェン (カタログ番号 T5648-1G、Sigma-Aldrich) が選択されました 54,55。 BV 活性を追跡するには、脂肪族ヘプタ-2-オン (カタログ番号 537683-100 ML、Sigma-Aldrich)、脂環式シクロヘキサノン (カタログ番号 29140-100 ML、Sigma-Aldrich)、および芳香族フェニルアセトン (カタログ番号135380-100G、Sigma-Aldrich）が選択されました56、57。

基質変換は、1.0 ～ 5.0 mM 基質 (1% メタノール)、0.10 mM NADPH、2.0 μM 酵素、5.0 μM 亜リン酸デヒドロゲナーゼ (PTDH、自社製造 58)、および 20 mM 亜リン酸ナトリウムを使用して二重に行いました。 最後の 2 つのコンポーネントは NADPH の再生システムとして使用され、コントロールには tAncFMO が含まれていませんでした。 すべての化合物は保存緩衝液 (50 mM KPi、250 mM NaCl、0.05% TritonTm X-100 還元、pH 7.5) で調製し、最終反応容量を 1.0 ml に調整し、4 ml バイアルに入れてから 30 °C でインキュベートしました。振盪しながら16時間。 フェニルアセトン、ヘプタン-2-オン、シクロヘキサノン、ベンジルフェニル硫化物およびメチル-p-トリル硫化物の変換はGC-MSで分析され、ベンジダミンとタモキシフェンの変換はHPLCで監視されました。 溶解度が低いため、タモキシフェン、ベンジダミン、およびベンジルフェニルスルフィドの変換は 1.0 mM 基質を使用して行い、残りの基質は 5.0 mM で試験しました。

GC-MS 分析では、内部標準として 0.02% (v/v) メシチレンを含む 1 倍量の酢酸エチルを加えて化合物を抽出しました。 サンプルを 20 秒間ボルテックスし、遠心分離し、有機相を無水硫酸マグネシウムを通して溶離しました。 GC-MS 分析は、HP-1 および HP-5 ms Agilent カラム (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) を使用して GCMS-QP2010 Ultra 装置 (SHIMADZU) で実行されました。 方法は以下の通りでした: インジェクターと検出器の温度は 250 °C、スプリット比は 5.0、注入量は 1 μl でした。 カラム温度を 50 °C で 4 分間保持し、10 °C/分で 250 °C まで上昇させ、5 分間保持しました。 基質と生成物の保持時間は、対応する質量スペクトルとともに補足情報 (表 S3) に表示されます。 変換率は基質の減少に基づいて計算され、内部標準で正規化されました。

300μlのサンプルを1200μlのアセトニトリルに希釈し、20秒間ボルテックスし、遠心分離した後、HPLC分析を実施した。 上清の分析は、逆相 HPLC を使用して実行されました。 サンプルを、Grace Alltima HP C18 カラム (5 μm、4.6 × 250 mm) を備えた JASCO AS2051 Plus HPLC システムに 10 μl の量で注入しました。 使用した溶媒は、0.1% v/v ギ酸を含む水 (A) およびアセトニトリル (B) であり、流速は 0.8 ml.min-1 でした。 ベンジダミンの場合、このメソッドは 35% B と 65% A の定組成流で 8 分間に相当しました。ベンジダミンとベンジダミン N-オキシドは、それぞれ 5.3 分と 5.7 分の保持時間で 308 nm で検出されました。 タモキシフェンの場合、方法は次のとおりでした。40 ～ 95% B の勾配で 30 分間、95% B で 3 分間、その後 5 分間 95 ～ 40% B の勾配を下げ、最後に 2 分間再平衡化しました。 タモキシフェンおよびタモキシフェン N-オキシドは、276 nm でそれぞれ 10.5 分および 11.7 分の保持時間で検出されました。 両方の生成物の同一性は、対応する標準を使用して確認され、変換は基質の枯渇に基づいて計算されました。

C4a-(ヒドロ)ペルオキシフラビンの形成を観察するために、フォトダイオードアレイ検出器または光電子増倍管(PMT)モジュールを備えたSX20ストップフロー分光計を使用してストップフロー実験を実施しました(Applied Photophysics、サリー、英国) 。 結果は、50 μl の 2 つの溶液を単一混合モードで混合することによって得られました。 すべての溶液は、50 mM リン酸カリウム、250 mM NaCl、および 0.05% TritonTm X-100 還元、pH 7.5、25 ℃で調製されました。 すべての反応で、8 ～ 15 μM の酵素濃度が使用され、測定は技術的に 3 回行われました。 必要に応じて、溶液に 5.0 mM グルコースを追加しました。 溶液を窒素で10分間フラッシュして酵素溶液を嫌気性にし、その後0.3μMグルコースオキシダーゼ(黒色アスペルギルス、VII型、カタログ番号G2133-50KU、Sigma-Aldrich)を添加して残留酸素を消費した。 tAncFMO のフラビン補因子を還元するために、1 ～ 1.2 当量の NADPH を酵素溶液に添加しました。 得られた溶液を、FADの漂白が完了し、FADH2への完全な還元が示されるまで、氷上でインキュベートした。 中間体形成の速度を決定するために、還元された酵素を、異なる濃度の二酸素を含む緩衝液と混合した。 酸素の最終濃度 (混合後 0.13、0.31、0.61、0.96 mM) は、嫌気性酵素溶液を (1) 空気飽和緩衝液と混合することによって達成されました。 (2) 等量の 100% アルゴンバッファーと 100% O2 バッファー。 (3) 100% O2 バッファー。 (4) 氷上の 100% O2 バッファー。 最後の溶液を除き、すべての溶液を室温で10分間バブリングした。氷上で行った。 観察された速度 (kobs) は、トレースを指数関数に当てはめることによって決定されました。 すべてのデータは、Pro-Data Viewer v4.2.12、Pro-Kineticist v1.0.13 (Applied Photophysics、英国サリー州)、および GraphPad Prism 6.05 (米国カリフォルニア州ラホーヤ) ソフトウェアを使用して分析されました。

定常状態速度論アッセイは、Jasco V-660 分光光度計を用いて技術的に 3 回繰り返して実行されました。 祖先タンパク質の酵素活性は、NADPH 消費をモニタリングすることによって測定されました (340 nm での吸光度、NADPH について ε340 = 6.22 mM-1 cm-1)。 速度論的分析に使用した緩衝液は、50 mM リン酸カリウム、250 mM NaCl、0.05% TritonTM X-100 還元、pH 7.5 でした。 分光光度計を 25 °C に設定し、酵素を添加して反応を開始しました。 基質の KM 測定には、100 μM NAD(P)H を使用しました。 NAD(P)H 脱共役速度は、基質の非存在下で二重に測定されました。

酸素親和性は、The Oxygraph+ (Hansatech Instruments Ltd.、英国) 酸素電極システムを使用して測定しました。 酵素（濃度範囲 3 ～ 12 μM）を NADPH 補因子および基質を含む空気飽和緩衝液と混合した後、酸素消費量をモニタリングしました。 すべての測定は二重に行われました。 室温では、空気飽和水には約 0.2 mM の酸素が含まれています。 したがって、過剰の NADPH 補因子 (0.6 mM) と基質 (メチル-p-トリル硫化物またはフェニルアセトン、2.5 mM) を反応混合物に添加して、酸素濃度が kobs 値に影響を与える唯一の要因となるようにしました。 酸素が完全になくなった時点で測定は終了しました。 kobs 値は、OxyTrace+ Windows® ソフトウェア (Hansatech Instruments Ltd.、英国) によって計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された祖先配列 (tAncFMO) は、アクセッションコード OP381052 (tAncFMO1-5)、OP381053 (tAncFMO5)、OP381054 (tAncFMO1-4)、および OP381055 (tAncFMO1-3) で Genbank データベースに寄託されています。 この研究で生成された実験データは、補足情報/ソース データ ファイルで提供されます。 系統解析のために収集されたデータセットは補足情報に提供されます。 この研究で使用された分類学的関係と進化のタイムスケール データは、TimeTree 5 知識ベース [http://www.timetree.org/] で入手できます。 この研究で使用された生物のシルエット画像は、PhyloPic データベース [http://www.phylopic.org/] で入手できます。 この研究で使用された構造データは、アクセッション コード: 6SEK (mAncFMO5) および 6SF0 (mAncFMO2) で PDB データベースから入手できます。 この研究で使用した配列データは、Genbank データベースでアクセッション コード OP381050 (mAcFMO1)、OP381047 (mAcFMO2)、OP381048 (mAncFMO3–6)、および OP381049 (mAncFMO5) で入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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AlphaFold モデルを提供し、ドッキング実験を行ってくれた Hein Wijma 博士に感謝します。 FMO の進化の歴史について議論してくれた Walter Lapadula 博士に感謝します。 この研究は、助成契約番号 847675 COFUND プロジェクト oLife (MLM) に基づく欧州連合の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラム、マリー スクウォドフスカ-キュリー助成契約 No. 722390 (GB) に基づく欧州連合の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラム、およびカリプロ財団 No. 2020-0894 (AM および MWF)。

Gautier Bailleul、Guang Yang などの著者も同様に貢献しました。

分子酵素学グループ、フローニンゲン大学、フローニンゲン、オランダ

ゴーティエ・バイユル、グァン・ヤン、マルコ・W・フライジェ、マリア・ローラ・マスコッティ

イタリア、パヴィアのパヴィア大学、生物学およびバイオテクノロジー学部「ラザロ・スパランツァーニ」

カラム・R・ニコル＆アンドレア・マテヴィ

IMIBIO-SL CONICET、サンルイス国立大学、生化学化学薬学部、サンルイス、アルゼンチン

マリア・ローラ・マスコッティ

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リストされているすべての著者が実験を実行したり、データを分析したりしました。 GB と CRN は精製と発現のプロトコルを確立し、MLM の指導の下で進化分析と祖先配列の再構築を実行しました。 GB はすべてのクローニング、突然変異誘発、変換実験を実行しました。 GB と GY は酵素を生成し、定常状態の反応速度を実行しました。 GY はストップフロー実験と酸素親和性実験を実施しました。 CRN は構造モデルを生成し、構造機構解析を実行しました。 GY、GB、CRN、MLM が数値を作成しました。 MLM が論文を執筆し、CRN、AM、MWF が編集しました。 著者全員が批判的なフィードバックを提供し、研究、分析、論文の形成に貢献しました。 MLM は AM と MWF の支援を受けて最初のアイデアを考案しました。

マリア・ローラ・マスコッティへの通信。

すべての著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Baiilleul, G.、Yang, G.、Nicoll, CR 他。 フラビン含有モノオキシゲナーゼにおける酵素機能の進化。 Nat Commun 14、1042 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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受信日: 2022 年 9 月 14 日

受理日: 2023 年 2 月 15 日

公開日: 2023 年 2 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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