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Aug 01, 2023

DGAT1 p.M435L および p.K232A 変異体の発症前への影響の分析

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8999 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

DGAT1 は脂肪代謝とトリアシルグリセリド合成において主要な役割を果たしています。 牛の乳生産形質を変化させる DGAT1 機能喪失変異体は、これまでに 2 つだけ報告されており、p.M435L と p.K232A です。 p.M435L バリアントはまれな変化であり、エクソン 16 のスキッピングに関連しており、その結果機能しない切断されたタンパク質が生成されます。また、p.K232A を含むハプロタイプは、いくつかの DGAT1 イントロンのスプライシング速度の変化に関連しています。 特に、イントロン 7 接合部のスプライシング速度の低下における p.K232A 変異体の直接的な因果関係は、MAC-T 細胞におけるミニ遺伝子アッセイを使用して検証されました。 これらの DGAT1 変異体は両方ともスプライス形成性であることが示されたため、HEK293T 細胞および MAC-T 細胞における p.M435L および p.K232A 変異体を再分析するための全長遺伝子アッセイ (FLGA) を開発しました。 p.M435L 変異体を保有する完全長 DGAT1 発現構築物でトランスフェクトされた細胞の定性的 RT-PCR 分析では、エクソン 16 の完全なスキッピングが強調されました。p.K232A 変異体を保有する構築物を使用して行われた同じ分析では、野生型と比較して中程度の差異が示されました。最後に、p.K232A を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた細胞の定量的 RT-PCR 分析では、イントロン 1、2 のスプライシング速度に有意な変化は示されませんでした。 7. 結論として、DGAT1 FLGA は、以前に生体内で観察された p.M435L の影響を確認しましたが、p.K232A 変異体がイントロン 7 のスプライシング速度を大幅に低下させるという仮説を無効にしました。

DGAT1 遺伝子によってコードされるジアグリセリド O-アシルトランスフェラーゼ 1 は、ジグリセリドとアシルコエンザイム A からトリグリセリドの合成を触媒する酵素です。2002 年、DGAT1 p.K232A ミスセンス変異体 (BTA14:611019AA>GC) は、牛の乳量と成分1. この変異の頻度は対象となる品種によって異なりますが、乳牛の主要な品種で一般的に見られます。 乳業における重要な経済的成果により、ウシ DGAT1 p.K232A 変異体の役割は広範囲に研究され、検討されてきました 2。 全般的に、p.K232A 変異体は、脂肪収量、脂肪含有量、タンパク質含有量の低下と、乳生成タンパク質と乳糖の収量の増加に関連していました。 機能の観点から、この変異体は、ヘテロ接合性およびホモ接合性の p.K232A キャリアで測定された乳脂肪率の減少と一致して、DGAT1 酵素活性を大幅に低下させることが示されました 3。 それに加えて、エクソン 8 内の隠れた 5' スプライシング部位 (5' SS) の使用も検出され、p.K232 対立遺伝子を持つ動物ではより顕著でした。 しかし、p.K232 対立遺伝子のホモ接合体、p.A232 対立遺伝子のホモ接合体、およびヘテロ接合体の動物間の異常/正常転写比の違いは、乳汁の表現型の変化を説明できる主要な要素としては同定されなかった。弱い3。

ごく最近、Fink et al. らは、相補的な in vivo および in vitro 方法に依存するアプローチを使用して、p.K232A バリアントのスプライス形成性をより深く調査しました 4。 375 頭の授乳牛と、DGAT1 遺伝子と重複する 1Mbp 間隔に存在する 3128 個の以前に帰属された配列変異体を表す乳房 RNA-seq データセットを使用して関連解析を行った後、p.K232A 含有ハプロタイプが in vivo で DGAT1 発現の低下と関連していることが観察されました。いくつかのイントロンのスプライシング率の変更。 興味深いことに、p.K232A バリアントは、イントロン 2 および 7 のスプライシングの修飾に関して関連する SNP のトップでした。 また、ウシ乳腺上皮（MAC-T）細胞におけるミニ遺伝子アッセイにより、この変異体がイントロン 7 のスプライシング速度を低下させることが明らかになった。これは、p.K232A が生体内で観察されるイントロン 7 のスプライシング修飾を引き起こすことを意味する。

Finkらから。 研究によると、インビボとインビトロの両方の証拠に基づいて、イントロン 7 スプライシング速度の変化は、p.K232A 変異体に直接起因する最も説得力のあるスプライシング効果であると考えられました。 さらに、著者らは、この変異体がインビボで後者と強く関連していることから、イントロン 2 のスプライシング速度の変化に対するこの変異体の影響の可能性を指摘したが、彼らが開発したミニ遺伝子構築物には DGAT1 が欠けていたため、この仮説を検証することができなかった彼らは、DGAT1 転写産物発現の変化が、p.K232A 変異体に関連する表現型効果に寄与している可能性があると結論付けました。

p.M435L バリアントは、Lehnert らによって発見された珍しい変化です。 数年前、乳タンパク質と脂肪含量の平均値からの重大な逸脱を特定するために、250 万頭の牛の授乳記録をスクリーニングしました5。 彼らは、脂肪含量が非常に低い牛1頭を含む異常な乳パラメータを持つ29頭の動物を除外し、その後、遺伝子マッピングと配列分析によって上記の変異体を特定した。 この変異種を保有する牛から採取した乳サンプルの詳細な組成からも、飽和/不飽和乳脂肪の比率が大幅に改善されていることが明らかになりました。 2度目に著者らは、野生型（WT）牛の肝臓から抽出した全RNAを用いて、あるいはヘテロ接合またはホモ接合状態でp.M435L変異体を保有する動物から抽出した全RNAを用いて、定性的および定量的RT-PCRを実施した。一方。 これらの RT-PCR 分析は、この変異体が DGAT1 エクソン 16 をほぼ完全にスキップすることを示しました。 得られたタンパク質はサッカロミセス セレビシエで発現されましたが、オレイン酸を補酵素 A からジアシルグリセロールに転移することができませんでした。 対照的に、同じ条件で発現された WT タンパク質は、通常の酵素産物を得るために必要なこの反応ステップを触媒することができます。 この最後の観察は、この研究で報告された異常な乳表現型を生じさせる際の p.M435L の原因となる役割を裏付けました。

Full-length gene assays (FLGA) have been routinely used to analyse numerous splicing variants within the human SPINK1 geneA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="#ref-CR6" id="ref-link-section-d326251e452">6,7,8,9,10 and 5’SS GT>GC or GC>GT variants in 43 different genesGT and GT>GC variants differ markedly in terms of their functionality and pathogenicity. Hum. Mutat. 41, 1358–1364 (2020)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR11" id="ref-link-section-d326251e459">11,GC variants capable of generating wild-type transcripts. Hum. Mutat. 40, 1856–1873 (2019)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR12" id="ref-link-section-d326251e462"> 12. バリアントのスプライス形成性を評価するには、ミニ遺伝子アッセイの方が FLGA よりも簡単に使用できるため、より一般的に使用されます。 ただし、FLGA には 2 つの大きな利点があります。 まず、配列コンテキストの性質と長さが RNA に影響を与えることが知られているため、エピソーマル発現ベクターによって生成されたプレ mRNA 転写物によって運ばれるスプライシング バリアントの分析は、遺伝子配列全体を統合する場合により生物学的に関連性が高くなります。構造と接合プロセス13、14、15。 次に、FLGA を使用すると、ディープイントロンを含むスプライシングに関するあらゆる種類の遺伝的変異の評価が可能になります。 したがって、我々は、堅牢な実験系でスプライシングに対する p.M435L と p.K232A の両方の効果を検証するために、ウシ DGAT1 FLGA を作成しました。

エクソン 1 からエクソン 17 までの全長 DGAT1 mRNA 転写物を、プライマーペア P1-P2 を使用して、トランスフェクトされていない MAC-T 細胞の 3 つの異なる調製物の全 RNA から増幅しました (図 1A)。 サイズがスプライスされた標準転写産物のサイズと一致する単一のアンプリコン (すなわち 1220 bp) がゲル電気泳動によって観察されました (図 1B)。 対照的に、プライマーペアP3-P4およびP5-P2をそれぞれ使用して、エクソン7〜9および15〜17をカバーする転写産物の標的領域を増幅すると、複数の産物が得られました（図1A、B、補足図1）。 これらは、スプライスされた DGAT1 転写物に対応するサイズを持ちますが、スプライスされていない形態および部分的にスプライスされた形態の間のサイズにも対応します。 最後に、MAC-T 細胞の DGAT1 遺伝子型解析により、それらが p.A232 (c.694GC) および p.M435 (c.1303A) についてホモ接合性であることが示されました (図 1C)。

MAC-T 細胞の内因性 DGAT1 スプライシング パターンの定性 RT-PCR 分析。 (A) ウシ DGAT1 遺伝子の構造を示す図。 青いボックスと線はそれぞれウシ DGAT1 エクソンとイントロンを表します。 プライマーペア P1-P2、P3-P4、および P5-P2 は赤色で示されます。 (B) MAC-T 細胞の 3 つの異なる調製物から得られた P1-P2、P3-P4、および P5-P2 RT-PCR 産物のゲル電気泳動。 スプライスされた製品 (s) とスプライスされていない製品 (u) は黄色の矢印で示され、その構造は右側に示されています。 (C) p.232 および p.435 の位置における MAC-T 細胞の遺伝子型。

p.K232 および p.M435 対立遺伝子を持つウシ DGAT1 の全ゲノム配列を pcDNA3.1 (+) 発現ベクターに挿入して、pcDNA3.1-DGAT1 (WT) 構築物 (図 2A) を取得し、これをトランスフェクトしました。 MAC-T 細胞株とヒト胎児腎臓 (HEK293T) 細胞株の両方で。 完全な DGAT1 転写物を増幅するために使用した定性的 RT-PCR では、両方の細胞株で予想される完全にスプライスされた DGAT1 転写物に対応するサイズ (すなわち 1450 bp) のアンプリコンが常に生成されました (図 2B)。 注目すべきことに、プライマー P6 および P7 が標的とする転写物の 5'UTR および 3'UTR 部分は、ウシゲノムではなく pcDNA3.1 (+) ベクターに関連しているため、この製品はもっぱら pcDNA3.1-DGAT1 構築物に由来しています。 、対照的に、プライマー P1 および P2 はそれぞれエクソン 1 およびエクソン 17 に一致します。

DGAT1 FLGA の検証。 (A) pcDNA3.1-DGAT1 (WT) コンストラクトを示す図。 青いボックスと線はそれぞれウシ DGAT1 エクソンとイントロンを表します。 黒い線はpcDNA3.1 (+) バックボーンを表します。 P6-P7 プライマー ペアとそのターゲット領域は赤色で示されます。 (B) pcDNA3.1-DGAT1 (WT) をトランスフェクトした細胞から得られた P6-P7 RT-PCR 産物のゲル電気泳動。

エクソン 16 スキッピングに対する p.M435L バリアントの効果は、エクソン 15 から 17 を含む定性 RT-PCR によって調査され、pcDNA3.1-DGAT1 (WT) および (M435L) 構築物の両方でトランスフェクトされた細胞で実行されました (図 3A)。 ）。 ヒト HEK293T 細胞株の使用は、ウシ MAC-T 細胞株の使用よりも好まれました。 実際、DGAT1 転写物の増幅に使用される PCR プライマーは、pcDNA3.1-DGAT1 コンストラクトによって生成される転写物のみを合成するため、分析を歪める内因性 DGAT1 転写物の増幅を回避するには、非ウシ細胞株を使用することが唯一の方法でした。ウシ特有のものです。

pcDNA3.1-DGAT1 (WT または M435L) 構築物でトランスフェクトされた HEK293T 細胞の定性的 RT-PCR 分析。 (A) 定性的 RT-PCR に使用されるプラスミド構築物の図。 pcDNA3.1-DGAT1 (WT) および pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) は、それぞれ p.M435 または p.L435 対立遺伝子を交互に保持しています。 青いボックスと線はそれぞれウシ DGAT1 エクソンとイントロンを表します。 黒い線はpcDNA3.1 (+) バックボーンを表します。 P5-P2 プライマー ペアとそのターゲット領域は赤色で示されます。 (B) pcDNA3.1-DGAT1 (WT または M435L) でトランスフェクトされた HEK293T 細胞から得られた P5-P2 RT-PCR 産物のゲル電気泳動。 アンプリコン 1 ～ 3 の構造を右側に示します。 NT、非トランスフェクト。 RT (-)、Superscript III を使用せずに RT-PCR を実行。 (C) サンガー配列決定による (B) のアンプリコン構造の検証。 エクソン-イントロン境界およびエクソン-エクソン境界のみが示されています。

RT-PCRにより複数の産物が得られ(図3B、C;補足図2)、これらを精製し、pCR4-TOPO TAベクターにクローン化し、配列決定した。 スプライスされていない、スプライスされた、またはエクソン 16 スキップされた転写物に対応する 3 つの主要な PCR 産物が同定されました。 エクソン 16 スキップされた転写物は、(WT) および (M435L) コンストラクトの両方で観察されました。 対照的に、正しくスプライスされた転写物に対応する産物は、(WT) 構築物についてのみ観察されました。

p.K232A バリアントの定性的効果は、p.M435L バリアントと同じアプローチに従って調査されました (図 4A)。 観察された転写物の性質に違いは見られませんでしたが、生成物の 1 つが p.K232A 変異体に多量に存在しているようです (図 4B、補足図 3)。 これは、3 つの増幅されたエクソンに加えて、イントロン 7 が依然として存在する、転写物の中間的な、部分的にスプライシングされた形態に対応します (図 4C)。 (WT) 条件と (K232A) 条件の両方で、100 bp をわずかに超える分子量では、非常に弱く拡散したバンドがほとんど見えませんでした。 これは、エクソン 8 内の潜在的なスプライシング部位の使用によって生成され、以前の研究で説明されている DGAT1 のマイナーな選択的スプライシング アイソフォームに対応する可能性があります 3,4。

pcDNA3.1-DGAT1 (WT または K232A) 構築物をトランスフェクトした HEK293T 細胞の定性的 RT-PCR 分析。 (A) 定性的 RT-PCR に使用されるプラスミド構築物の図。 pcDNA3.1-DGAT1 (WT) および pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) は、それぞれ p.K232 または p.A232 対立遺伝子を交互に保有しています。 青いボックスと線はそれぞれウシ DGAT1 エクソンとイントロンを表します。 黒い線はpcDNA3.1 (+) バックボーンを表します。 P3-P4 プライマー ペアとそのターゲット領域は赤色で示されます。 (B) pcDNA3.1-DGAT1 (WT または K232A) でトランスフェクトされた HEK293T 細胞から得られた P3-P4 RT-PCR 産物のゲル電気泳動。 アンプリコン 1 ～ 3 の構造を右側に示します。 NT、非トランスフェクト。 RT (-)、Superscript III を使用せずに RT-PCR を実行。 (C) サンガー配列決定による (B) のアンプリコン構造の検証。 エクソン-イントロン境界およびエクソン-エクソン境界のみが示されています。

Fink らによる以前の研究では、p.K232A 変異体がイントロン 7 のスプライシングを顕著に減少させることが示され、イントロン 2 のスプライシングを変化させる疑いもありました。このため、我々は相対的なスプライシングを評価するために定量的 RT-PCR を設計しました。接合部2および7におけるスプライスされた転写物およびスプライスされていない転写物の発現(図5A、B)。 また、ジャンクション 1 もジャンクション 2 と同様に Fink らの研究に含まれていなかったため、分析しました。 技術的な制約のため。 定性的RT-PCRとは対照的に、定量的RT-PCRはDGAT1の内因性発現を定量化して除去することができるため、実験を行うためにMAC-T細胞株を選択した(図5A)。 pcDNA3.1-DGAT1 (WT) および (K232A) コンストラクトを並行して分析して、各接合部 1、2、および 7 のスプライシングの平均パーセンテージ、スプライスされた転写物の平均発現、およびスプライスされていない転写物の発現の平均を決定しました（図 5C）。 試験した対立遺伝子とは無関係に、これら 3 つのパラメーターについて接合部間で差異が観察され、接合部 1、2、および 7 が異なるスプライシング効率を示すことが示されました。 反対に、特定のジャンクションを考慮した場合、これらのパラメーターのいずれについても (WT) 条件と (K232A) 条件の間に有意な差は観察されませんでした。

pcDNA3.1-DGAT1 (WT または K232A) 構築物をトランスフェクトした MAC-T 細胞の定量的 RT-PCR 分析。 (A) 定量的 RT-PCR 実験の実験ワークフロー。 (B) 定量的 RT-PCR に使用されるプラスミド構築物の図。 pcDNA3.1-DGAT1 (WT) および pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) は、それぞれ p.K232 または p.A232 対立遺伝子を交互に保有しています。 青いボックスと線はそれぞれウシ DGAT1 エクソンとイントロンを表します。 黒い線は、pcDNA3.1 (+) または pcAT7-Glo1 バックボーンを表します。 プライマーペアは、エクソン-エクソン境界をターゲットとする場合は赤色で示され、エクソン-イントロン境界をターゲットとする場合は緑色で表示されます。 詳細については、材料と方法および表 1 を参照してください。(C) 3 つの独立したデータから計算された、ジャンクション 1 (J1)、ジャンクション 2 (J2)、およびジャンクション 7 (J7) のスプライシングの平均パーセンテージ、平均スプライスされた転写産物発現、および平均スプライスされていない転写産物発現トランスフェクション実験は三連で実施した。 バーズ、SD。 DGAT1 の内因性発現および DNA 汚染に起因する相対発現を、試験条件 RT (+) で得られた相対発現から差し引いて、ここに示す最終相対発現を計算しました。 (A、B、C) の条件 (WT) と (K232A) の間に有意差は観察されませんでした。

最も信頼性の高いアッセイを設計するために、定量的 RT-PCR 実験の精度を低下させる可能性がある 2 つの技術的バイアス、すなわち i) DGAT1 の内因性発現、および ii) プラスミド DNA による RNA サンプルの汚染を考慮しました。 これら両方の誤差源の試験条件で測定された相対発現に対する平均相対寄与は、考慮された定量的 RT-PCR に関係なく、5 % 未満でした (図 6)。 材料と方法のセクションで説明したように、DGAT1 の内因性発現および DNA 汚染に起因する相対発現を、試験条件 RT (+) で得られた相対発現から差し引いて、図 5C に示す補正された相対発現を得ました。

試験条件 RT (+) で定量的 RT-PCR によって測定された相対発現に対する DGAT1 内因性発現およびプラスミド DNA 汚染の平均相対寄与は、3 回実行された 3 つの独立したトランスフェクション実験から計算されます。 スプライスされたジャンクション (S)、スプライスされていないジャンクション (U)。 バーズ、SD。

DGAT1 は、乳の表現型において重要な役割を果たしているため、ウシ遺伝学で最も研究されている遺伝子の 1 つです。 ただし、これまでのところウシで報告されている DGAT1 の機能喪失変異体は 2 つだけです。 p.K232A および p.M435L 変異体は、生体内でのスプライシング欠陥と関連しています4,5。 ただし、それらのスプライス形成性は、堅牢な実験系ではまだ検証されていません。 私たちは、スプライシングに対するこれらのバリアントの影響を検証するために DGAT1 FLGA を開発しました。これは、私たちの知る限り、このタイプの分析にとって最も信頼できるシステムであると考えています。 p.M435L は in vivo でエクソン 16 のスキッピングを引き起こすため、FLGA を定性的な方法で使用して、エクソン 15 からエクソン 17 を含む領域の DGAT1 転写産物の配列を分析しました。 pcDNA3.1-DGAT1 から生成された DGAT1 転写産物(WT) コンストラクトはエクソン 16 を保持しており、p.M435L バリエーションをコンストラクトに導入すると、このエクソンが完全にスキップされました。 Lehnert らによる in vivo 研究では、p.M435L のホモ接合性ウシでごく少量の正常にスプライスされた転写産物が検出され、これは我々のシステムで得られた結果と同等の結果でした 5。 これにより、p.M435L バリアントの効果が検証され、他の DGAT1 スプライシング バリアントを分析するための FLGA 法の使用が裏付けられました。 また、FLGA を使用して、(WT) 条件では、in vivo では観察されない、エクソン 16 スキップされた転写産物の少量の存在も観察しました。 これは、FLGA 法では完全な転写配列との関連でバリアントを研究できるものの、内在性転写物のスプライシング パターンと FLGA を使用して得られた転写物との間に差異が残る可能性があることを示しています。 より一般的には、FLGA システムが予期したトランスクリプトを生成しない場合、または予期しないトランスクリプトを大量に生成する場合は、FLGA システムを使用しないことをお勧めします。

その後の p.K232A 変異体の定性分析により、この変異体では WT 条件と比較してわずかに異なるスプライシング パターンが明らかになりました。 イントロン 7 が保持された転写物の部分的にスプライスされた形態が、p.K232A 変異体でより大量に観察されました。 この最初の観察は、Fink らの仮説と一致しました。 p.K232A バリアントはジャンクション 7 のスプライシング速度を低下させるが、エクソン 7 ～ 9 を含む正常にスプライシングされた産物に関しては、WT 条件と p.K232A 条件の間に差は観察されませんでした。この最後の点は、Fink の結果と矛盾していました。他。 一方、定性的 RT-PCR では増幅産物を正確に定量することができないことに留意する必要があり、Fink らによって行われたように、この問題を解決するには定量的 RT-PCR を開発する必要がありました。 。

Thus, we attempted to replicate the most compelling result from the Fink et al. study which was the decrease in the splicing rate of junction 7 caused by the p.K232A variant4. The possible effects on the splicing of introns 1 and 2 were also tested. In a manner comparable to theirs, we have set up quantitative RT-PCR and we have measured DGAT1 spliced and unspliced transcripts relative expression at each junction, as the average percentage of splicing, in MAC-T cells transfected with pcDNA3.1-DGAT1 constructs. We did not observe any significant difference between (WT) and (K232A) conditions on any splicing parameters related to junction 1, 2 or 7. Conversely, the minigene assay developed by Fink et al. showed a 4-fold increase in terms of spliced transcript relative expression for the p.K232 allele by comparison to the p.A232 allele in the context of the junction 7, what resulted in a dramatic rise of intron 7 splicing ratio. Such a strong discordance may seem a little surprising but it can be explained by differences in terms of methodological choices or technical considerations between both studies. First, and as we have mentioned in the introduction, using a truncated or chimeric genomic sequence of a gene to perform episomal splicing reporter assays is less reliable than using the full gene sequence. A minigene harbouring all exons of a gene but lacking several of its introns as used by Fink et al. may generate strong false positives. This kind of bias has been unmasked by Wu et al., who used FLGA to analyse the human SPINK1 c.194G>A variant previously classified as strongly spliceogenic using minigene assayA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR6" id="ref-link-section-d326251e945"> 6、16。 彼らは、この変異体が実際にはスプライシングに影響を及ぼさないことを明らかにしました。 その後、細胞株ベースの実験は、特に異なる実験者、異なる研究室、異なる細胞調製物を使用して実施した場合、再現性の欠如に悩まされる可能性があることも認識されています17。 このことが、私たちの研究と Fink らの研究の間で矛盾する結果をもたらした可能性があります。

我々は、この変異体自体は DGAT1 ジャンクション 1、2、および 7 のスプライシングに実質的な影響を及ぼさないと結論付けました。 それ以外の点では、我々の結果は、生体内で観察される発現およびスプライシング効率の変動が非常に弱く、数パーセント程度であるという事実と一致しています4。 このような小さな変動は、定量的 RT-PCR では検出できない場合があります。 私たちは、p.K232A 変異体はおそらくそれ自体でスプライシングに小さな影響を及ぼしていると考えています。これは、それがエキソンのスプライシングエンハンサーに位置しているという事実と、定性的 RT-PCR 分析によって影響の可能性が観察されたという両方の事実によって裏付けられています。タンパク質の機能に対するその影響と比較すると、比較的逸話が残っています。 上で示唆したように、Fink らによって観察されたように、この変異体はジャンクション 7 のスプライシングに非常に強い影響を及ぼします。 彼らのミニ遺伝子システムに含まれていたものは、おそらく最適ではない方法論の選択に関連したアーチファクトでした。

私たちの研究で取り上げられた最後の質問は、ミニ遺伝子アッセイまたは FLGA を使用する場合の特定の技術的バイアスの影響を検証することの関連性に関するものでした。 RT-PCR デザインによっては、i) 標的遺伝子の内因性発現とエピソーム発現との混同、および ii) プラスミド DNA18 による全 RNA の混入により、発現プラスミドによって生成される mRNA の特異的定量が問題となる可能性があります。 内因性発現とエピソーム発現間の干渉は 2 つの方法で回避できます。 まず、p.M435L で行ったように、種特異的プライマーを使用して、異なるが遺伝的に密接に関連した種からの細胞株と組み合わせて、プラスミド構築物から標的を独占的に増幅します。 あるいは、標的遺伝子がまったく発現されていない細胞株を使用することによっても可能です。 スプライシングコードは近縁種間で高度に保存されているため、標的遺伝子とは異なる組織または種に由来する細胞株を使用することは実際には問題ではありません19。また、異なる臓器から単離された細胞株では、ほとんどのスプライシングレポーターアッセイの実行に使用した場合の時間比較可能な結果20。 例えば、HEK293T 細胞は、ミニジーンおよびミディジーンアッセイまたは FLGA を使用して、多くの異なる組織で発現する数十の遺伝子の数百の変異体を分析するために成功裏に使用されています (たとえば、序文または 21、22、23 で引用した参考文献を参照)。 また、DNase 処理を使用することで、プラスミドの汚染を許容できる速度まで減少できることも示しました。 混入プラスミド DNA の増幅を回避するもう 1 つの選択肢は、十分に長いイントロンによって分離されたエクソン上にのみ RT-PCR プライマーを設計することですが、これは常に可能であるとは限りません 24。 MAC-T 細胞で定量的 RT-PCR を行うために使用した実験条件下では、内因性発現とプラスミドの混入を考慮すると、DGAT1 相対発現は平均して 5% 未満でした。 このような汚染は低いと考えられ、エラーの主な原因にはなりません。 DGAT1 相対式を計算するときに、結果を大きく変えることなく、これを無視することもできました。 それにもかかわらず、ミニジーンまたは FLGA アッセイを開始する前に誰もがこのことを認識し、RT-PCR デザインが内在性転写産物または汚染プラスミドの増幅を可能にする可能性がある場合は、このレベルの汚染を定量化する必要があると私たちは考えています。 実際、これらの汚染が多い場合、結果の信頼性が変化する可能性があります。 最後に、定性 RT-PCR を実行する際には、プラスミドのコンタミネーションも考慮する必要がある問題であることを明記することが重要です。 このような RT-PCR では、定量的 RT-PCR で行ったように、汚染を定量化し、目的のシグナルからそれを差し引くことはできません。 したがって、DNAse 処理の追加ステップを実行するなど、RNA 内のプラスミド DNA 汚染の痕跡をすべて除去するために特別な努力をする必要があります。

最後に、FLGA メソッドは最も堅牢なエピソーマル スプライシング レポーター アッセイであるため、特に低型スプライシング バリアントや複雑な機構を伴うバリアントを分析する場合には、スプライス形成バリアントの分析に FLGA メソッドを使用することをお勧めします。 もちろん、ミニ遺伝子アッセイは依然として、相補的な機能、遺伝、および表現型データと組み合わせて、多くの状況によく適合する有用なツールであり続けます。

最初のエクソンの終わりから最後のエクソンの始まりまでの DGAT1 ゲノム配列 (chr14: 604,331-612,548) を含む 8218 bp の断片がウシゲノム DNA サンプルから増幅されました。 これは、ヘテロ接合状態で DGAT1 p.K232A 変異体を保有するホルスタイン種の牛から得られたもので、以前に全ゲノム配列が決定されていました 25。 ロングレンジ PCR は、25 μL 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche)、および各プライマー C1 および C2 (表 1) をそれぞれ 0.3 μM 含む氷上で調製した 50 μL 反応混合物中の 100 ng DNA を用いて実行しました。 PCR プログラムには、95 °C で 3 分間の初期変性、98 °C で 20 秒の変性を 32 サイクル、70 °C で 15 秒のアニーリング、72 °C で 8 分 30 秒の伸長、および最終72 °C で 1 分間の伸長ステップ。 アンプリコンはQIAquick PCR Purificationキット(Qiagen)を用いて精製した。 メーカーの指示に従って、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を用いて、以前に生成したアンプリコンを挿入する前に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現プラスミドをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで二重消化した。 このプロセスから得られたいくつかの構築物をサンガー配列決定によって分析して、位置 p.232 および p.435 の配列をチェックしました。 p.K232 および p.M435 対立遺伝子を持つプラスミドを pcDNA3.1-DGAT1 (WT) 構築物として選択し、続いて QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) または NucleoBond Xtra Midi EF (Masherey Nagel) を使用して生成し、以下を使用して定量しました。 NanoDrop™ One (Thermo Scientific)。 最後に、BamHI と XhoI による二重消化によって構築物を検証し、構築物に挿入された DGAT1 遺伝子の配列とクローニングに使用したゲノム DNA の配列をサンガー配列決定によって完全に検証しました。 PCR 増幅ステップ中に 2 つの不要な変異がコンストラクトに導入されました (つまり、BTA14:607550C>T、BTA14:608021C>T) が、それらはスプライス部位の外側に位置し、研究された 2 つの変異体から遠く離れていました。

DGAT1 p.M435L (c.1303A>C) および p.K232A (c.694AA>GC) バリアントを、QuikChange II XL 部位特異的変異誘発キット (Agilent) を使用して pcDNA3.1-DGAT1 (WT) コンストラクトに導入しました。テクノロジー）。 突然変異誘発は、2.5 U PfuUltra HF DNA ポリメラーゼ、1 μl dNTP mix、5 μl 10×反応バッファー、3 μl QuikSolution、20 ng pcDNA3.1-DGAT1、および 125 ng の各突然変異誘発プライマー M1 および M2 を含む 51 μl 混合物中で実行されました。代わりに M3 と M4 (表 1)。 PCR プログラムでは、95 °C で 1 分間の初期変性、その後 95 °C で 50 秒の変性、60 °C で 50 秒のアニーリング、および 68 °C で 28 分間の伸長を 18 サイクル行いました。最終伸長は68℃で7分間。 PCR 後の反応混合物を DpnI で 37 °C で 1 時間処理し、得られた生成物 4 μL を XL10-Gold Ultracompelled Cell (Agilent Technologies) に形質転換しました。 形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、次いで、いくつかの選択されたコロニーを使用して、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてミニプレッププラスミド産生を調製した。 ミニプレップ プラスミドは、目的の置換の導入が成功したかどうかを検証するためにサンガー シーケンシングによって分析され、大規模な NucleoBond Xtra Midi EF プラスミド生産が 1 回実行され、各バリアントについて定量されました。 p.M435Lおよびp.K232A変異体を含む構築物を、それぞれpcDNA3.1-DGAT1 (M435L)およびpcDNA3.1-DGAT1 (K232A)と名付けた。

HEK293T細胞を、10％ウシ胎児血清（Sigma Aldrich）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Gibco）中で培養した。 MAC-T 細胞は、4 mM L-グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1 μg/L ヒドロコルチゾンおよび 50 mg/L インスリンを補充した 10% ウシ胎児血清を含む DMEM 中で培養しました。 トランスフェクションの24時間前に、6ウェルプレートのウェルあたり3×105個の細胞を播種しました。 定性的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) 分析には、QIAprep Spin Miniprep Kit を使用して抽出した 1 μg の pcDNA3.1-DGAT1 (WT または M435L) プラスミドを 3 μl のリポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬 (Invitrogen) と混合して使用しました。ウェルごとのトランスフェクション。 リアルタイム定量的 RT-PCR 分析では、総量 1 µg になるように pcDNA3.1-DGAT1 (WT または K232A) を等モル比で pcAT7-Glo1 と混合し、その後 3 µL のリポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬と混合しました。 定量的 RT-PCR に使用したプラスミドはすべて NucleoBond Xtra Midi EF を使用して抽出されました。 この研究で使用した pcAT7-Glo1 ベクターは、コネチカット大学の Scott I. Adamson と Brenton R. Graveley によって提供され、イントロン 1 の中央にあるスプライス アクセプター サイトが削除されたプラスミドの改変バージョンでした 20。 。 バックグラウンド対照条件として、同じモル量を使用して、pcDNA3.1-DGAT1 を pcDNA3.1 (+) 空のプラスミドに置き換えました。 注目すべきことに、pcDNA3.1 (+) は pcDNA3.1-DGAT1 より分子量が低いため、最終量 1 μg を一定に保つために pGL3-basic プラスミド (Promega) を混合物に添加しました。 トランスフェクションの 48 時間後、RNeasy Mini Kit (Qiagen) を使用してオンカラム DNase 処理を加えて全 RNA を抽出しました。 プラスミド汚染による干渉を受ける定性的 RT-PCR を目的とした RNA (つまり、FLGA のコンテキストで実行される RT-PCR P5-P2 および P3-P4、RT-PCR デザインの説明については以下を参照) は、追加の RNA クリーンアップに提出されました。 RNeasy Mini Kit (Qiagen) を使用したステップ。 RT は、1 µg RNA、2.5 µM Oligo(dT) 20、500 µM 各 dNTP、5 mM MgCl2、5 mM ジチオスレイトール、40 U RNaseOUT および 200 を使用して、RT-PCR 用 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen) を使用して実行されました。 U Superscript III は製造元の指示に従ってください。 あるいは、FLGA のコンテキストで実行される定性的 RT-PCR P5-P2 および P3-P4 には 100 ng RNA のみが使用されました。 相補的 DNA (cDNA) を 2 U RNaseH (Invitrogen) で分解しました。 各 RNA サンプルについて、SuperScript III 酵素を含まないネガティブ コントロールを作成して、全 RNA サンプル内の DNA 汚染を評価しました。

基本的に、定性的 RT-PCR は、1.25 μL GoTaq® DNA ポリメラーゼ (Promega)、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTP、表 1 に記載の 0.5 μM プライマーペア「P」、および 2 μL cDNA を含む 50 μL 反応混合物中で実行されました。 FLGA のコンテキストで実行された定性 RT-PCR P5-P2 および P3-P4 には 5 μL の cDNA が使用されたことに注意してください。 プライマーペア P1-P2、P3-P4、P5-P2、および P6-P7 を使用して、それぞれエクソン 1 ～ 17、エクソン 7 ～ 9、エクソン 15 ～ 17、および pcDNA3.1 5'UTR ～ 3'UTR を含む領域を増幅しました。 。 PCR プログラムでは、95 °C で 2 分間の初期変性を行い、続いて 95 °C で 30 秒の変性、58 °C で 30 秒のアニーリング、72 °C で 1 分 30 秒の伸長を 30 サイクル行いました。最終伸長ステップは 72 °C で 5 分間。 主要なPCR産物をゲル精製し、製造業者の指示に従ってpCR4-TOPO TAベクター(Invitrogen)にクローン化した。 次いで、同定される各転写物に対応するクローンの配列を、ユニバーサルプライマーM13フォワードおよびリバースを使用するサンガー配列決定によってチェックした。

pcDNA3.1-DGAT1およびpcAT7-Glo1の両方を同時トランスフェクトしたMAC-T細胞から抽出した全RNAを定量的RT-PCRによって分析した。 pcAT7-Glo1 を参照遺伝子として使用し、Pfaffl の効率補正計算モデルに従って、pcDNA3.1-DGAT1 に由来する転写物のスプライスまたはスプライスされていない接合部の相対発現を計算しました。 図5Bおよび表1に記載されているように、DGAT1スプライス転写物の発現は、2つの連続するエクソンにまたがるプライマーペアを使用して定量化されました。つまり、ジャンクション1についてはエクソン1のQ1およびエクソン2のQ2、ジャンクション1についてはエクソン2のQ4およびエクソン3のQ5です。 DGAT1 のスプライスされていない転写産物の発現は、1 つのエクソンと次のイントロンにわたるプライマー ペア、つまりエクソン 1 の Q1 とイントロン 1 の Q3 を使用して定量されました。ジャンクション 1、エクソン 2 の Q4、ジャンクション 2 のイントロン 2 の Q6、ジャンクション 7 のエクソン 7 の Q7 とイントロン 7 の Q9 に加えて、実験の偏りを避けるために、空の pcDNA3 でトランスフェクトされた細胞からの MAC-T DGAT1 の内因性発現.1 (+) を各トランスフェクション実験で並行して測定し、pcDNA3.1-DGAT1 の値から差し引いてバックグラウンド シグナルを除去しました (図 5A)。 さらに、RT-PCR ネガティブコントロール RT (-) を使用して、試験条件で使用した各 RNA サンプル中の推定プラスミド DNA 汚染を評価し、RT (+) 実験で測定された DGAT1 相対発現からそれを差し引くことができました。テスト条件の。 これは、Superscript III 酵素を使用せずに DGAT1 RT-PCR を実行することによって取得されました。 RT (-) サンプルで DGAT1 PCR を実行した後、各 RNA サンプルのプラスミド汚染によって生成された DGAT1 相対発現の計算は、対応する RT からの参照シグナルと比較して RT (-) 実験からの DGAT1 シグナルを発現させることによって行われました ( +) 実験。 次に、プラスミド DNA の混入を表す結果として得られた DGAT1 相対発現を、RT (+) 試験条件でスプライスされた転写物とスプライスされていない転写物の相対発現を評価する DGAT1 RT-PCR の相対発現から差し引いて、図 5C に示す補正された DGAT1 相対発現を得ました。 最後に、所定の接合部で観察されたスプライシングの平均パーセンテージは、スプライスされた転写物の発現の平均を総転写物の発現の平均で割ることによって得られました。 3 つの独立したトランスフェクション実験を各条件について 3 回ずつ分析し、各種類の分析で pcDNA3.1-DGAT1 (WT) と (K232A) の間で観察された差を、閾値 p < 0.05 でスチューデントの t 検定によって有意性について評価しました。

技術的には、定量的 RT-PCR は QuantStudio 12k Flex (Applied Biosystems) で 3 回実行されました。 反応混合物には、総量中に 10 μL の SYBR™ Master Mix PCR Power SYBR™ Green (Applied Biosystems)、表 1 および図 5B に記載の 0.6 μM プライマーペア「Q」、および 5 μL の 40 倍希釈 cDNA が含まれていました。 20μL。 PCR プログラムには、50 °C で 2 分間の第 1 ステップと 95 °C で 10 分間の第 2 ステップがあり、その後、95 °C で 15 秒間の変性を 40 サイクル、60 °C で 1 分間のアニーリングと伸長を行いました。分。 続いて、95 °C で 15 秒、60 °C で 1 分間、および 95 °C で 15 秒からなる融解曲線プログラムを実行しました。

Puregene 細胞 & 組織キット (Qiagen) を使用して、150 万個の MAC-T 細胞を含むペレットを使用して DNA 抽出を実行しました。 DGAT1 のエキソン 7 から 9 および 15 から 17 にわたるゲノム領域を、「定性 RT-PCR」で上記と同じ条件下で、プライマー対 P3-P4 および P5-P2 をそれぞれ使用して、この DNA から PCR によって増幅しました。 得られたアンプリコンを、同じプライマーを使用してサンガー配列決定によって分析し、DGAT1 遺伝子上の位置 p.232 および p.435 での MAC-T 遺伝子型を決定しました。

著者らは、この研究の結果を裏付けるデータが論文内で入手できることを確認しています。

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リファレンスをダウンロードする

pcAT7-Glo1 ベクターは、コネチカット大学の Scott I. Adamson および Brenton R. Graveley からのご厚意により寄贈されました。 HEK293T 細胞株は、INRAE の GABI ユニットの Sophie Dhorne-Pollet からの親切な贈り物でした。

Paris-Saclay University, INRAE, AgroParisTech, GABI, 78350, Jouy-en-Josas, France

ニコラ・ガイアーニ、ロレーヌ・ブルジョワ＝ブルネル、ドミニク・ロシャ、アルノー・ブーリング

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NG と AB: この研究を考案し、設計しました。 NG および LBB: 実験を実行しました。 NG、DR、AB: データを分析しました。 AB: 執筆—原案の準備。 NG、DR、AB: 執筆 - レビューと編集。 すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

アルノー・ブーリングへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Gaiani、N.、Bourgeois-Brunel、L.、Rocha、D. 他。 全長遺伝子アッセイにおけるプレ mRNA スプライシングに対する DGAT1 p.M435L および p.K232A バリアントの影響の分析。 Sci Rep 13、8999 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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受信日: 2023 年 1 月 11 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

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