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Aug 08, 2023

内因性4の構造解析

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 552 (2023) この記事を引用

1081 アクセス

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体 (OGDHc) はトリカルボン酸サイクルに関与し、多段階の反応でα-ケトグルタル酸を脱炭酸し、スクシニルを CoA に転移し、NAD+ を還元します。 OGDHc 酵素成分は代謝において極めて重要な役割を果たしているため、単独で研究されてきました。 しかし、内在性 OGDHc 内でのそれらの相互作用は依然として解明されていません。 ここでは、活性状態にある好熱性、真核生物、天然の OGDHc の組織化を確認します。 生化学、生物物理学、生物情報学的な手法を組み合わせることで、その組成、3D 構造、分子機能を 3.35 Å の解像度で解析します。 さらに、さまざまな構造適応を示す OGDHc コア (E2o) の高分解能クライオ EM 構造を報告します。 これらには、OGDHc に関与する酵素の相互作用を制限する水素結合パターン (E1o-E2o-E3)、サブユニット間通信を駆動する静電トンネリング、E2o と E3 を接続する柔軟なサブユニット (E3BPo) の存在が含まれます。 スクシニル CoA を産生する天然細胞抽出物のこのマルチスケール分析は、医学的価値とバイオテクノロジー的価値の複雑な混合物の構造機能研究のための青写真を提供します。

オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体 (OGDHc) は、トリカルボン酸回路 (TCA) における代謝フラックスの主要な調節因子の 1 つであり、これは細胞が厳密な制御下で OGDHc の量と活性を維持することを意味します 1,2。 真核生物では、OGDHc はミトコンドリアで活性ですが、複合体の一部は核にも局在し、ヒストンのリシンサクシニル化を行っています 3。 OGDHc 触媒反応 (オキソグルタル酸 (α-ケトグルタル酸) からスクシニル CoA への脱炭酸) は、エネルギー生産、ミトコンドリアと細胞質間の代謝相互作用、および神経伝達物質の代謝にとって重要です。 これは、オキソグルタル酸（α-ケトグルタル酸）が炭水化物と脂肪酸の酸化中にTCAサイクルで生成され、グルタミン酸の酸化的脱アミノ化中にグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって生成されるためです。 さらに、還元等価物を細胞質からミトコンドリアに輸送するリンゴ酸-アスパラギン酸シャトルの一部としてグルタミン酸アミノ基転移によっても生成されます。 代謝における OGDHc の重要な位置、および脳内の OGDHc 活性の低下と神経変性との関連性は、広範な研究を刺激しています 4,5。 さらに、OGDHc は活性酸素種 (ROS) に対して非常に感受性が高く 6、酸化ストレスによるその阻害の可能性は、細胞の全体的な代謝に有害であることが判明する可能性があります。 このような癌関連の細胞状態は、特にオキソグルタル酸が p53 媒介腫瘍抑制のエフェクターであることを考慮すると、OGDHc 活性に影響を与える可能性があります 8。 したがって、OGDHc の構造と機能の関係を理解することは特に興味深いことです。

分子レベルでは、OGDHc は 3 つの酵素、すなわち E1o (オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、EC 1.2.4.2)、E2o (ジヒドロリポイル スクシニルトランスフェラーゼ、EC 2.3.1.61)、および E3 (ジヒドロリポイル デヒドロゲナーゼ、EC 1.8) の複数コピーのメガダルトン サイズの集合体です。 1.4）。 E2o は、立方体集合体で 24 コピーの安定な化学量論を持つ複合体のコアを形成しますが、E1o タンパク質と E3 タンパク質はその周囲に集合して、化学量論的にも構造的にも未知の高次代謝物で完全な反応を実行します（図 1A）。 ）。 OGDHc 単一酵素成分は構造的に解明されており、その個別のステップの速度論的特徴付けが研究されています 9,10,11 (図 1B)。しかし、それらの相互通信は不明であり、したがって、この代謝の基礎となる構造機能研究の妨げとなっています。 その内因性の構造と機能を調査するという課題のため、架橋ベースのモデリングと組み合わせた最新の質量分析分析が最近採用され、OGDHc の活性を調査することなく低分解能でサブユニットの近接性に関する洞察が得られました 12。 これは、数十年にわたる研究にもかかわらず、代謝物がまだ機能的実体としてインビトロで再構成されていないという事実によるものです。 さらに、リポイル中間体を 1 つの活性部位から次の活性部位 (E1o → E2o → E3) に移動させるリポイル ドメイン (LD) は、柔軟性の高い E2o アームの一部であり、従来の構造法による研究では特に課題となっています。 OGDHc 相互コミュニケーションに寄与する可能性のあるサブユニット、つまり KGD413 などの追加の構造要素が関与する可能性があるため、複合体の特性評価はさらに複雑になります。

OGDHc 全体的なアーキテクチャに関する以前の知識を概略的に表したもの。 立方体コアは 24 個の E2o タンパク質で構成され、規則的な LD ドメインで終わる拡張された柔軟なリンカーと、周囲の E1o および E3 二量体を備えています。 B OGDHc の完全な反応スキーム。 C FM464 で染色した赤色の細胞膜を有する、単離された C. サーモフィラム フィラメントの蛍光顕微鏡写真。 D FM464 で染色した赤色の細胞膜を持つ単一の C. サーモフィラム フィラメントの蛍光顕微鏡写真。 E MiOr で染色した 1 本の C. サーモフィラム フィラメントの蛍光顕微鏡写真。非常に豊富なミトコンドリア含有量が緑色で表示されています。 F C. サーモフィラム フィラメントの凍結固定超薄切片の透過型電子顕微鏡画像。 「M」では、画像内のミトコンドリアに注釈が付けられます。 G F に表示されるミトコンドリアの超微細構造を拡大表示します。C. サーモフィラム ミトコンドリアのリボン状のクリスタが表示されます (「RLC」と注釈が付けられています)。

この研究では、粗ライセートの単一ステップ分画後のチェトミウム・サーモフィラム由来のネイティブライセート画分に関連して、OGDHc代謝物の構造を解明するよう努めています（補足図1）。 C. Thermophilum は、最適増殖温度 54 °C の好熱性糸状菌であり、そのタンパク質およびタンパク質複合体が本来持つ熱安定性により、OGDHc や他のタンパク質複合体などの多成分標的に焦点を当てた構造研究にとって理想的なモデルとなります 14 、15、16。 好熱性細胞抽出物の固有の利点を、その組成と構造を詳しく分析しながら明らかにします。 私たちは生化学的アッセイを利用して、スクシニル CoA を生成する複合体の速度論的パラメーターを明らかにし、そのすべての成分を同定し、極低温電子顕微鏡、架橋、および人工知能 (AI) を活用して、厳密なデータ収集により高解像度で複合体の巨大構造を解明します。戦略。 全体として、一過性の酵素間相互作用を決定する柔軟な領域、OGDHc中間体を静電的に伝達する酵素クラスター、および複合体全体に重要なOGDHcの高次構造によって強調される、OGDHcが豊富な細胞抽出物のマルチスケールのスナップショットを提供します。関数。

好熱性真菌 C. Thermophilum を 54 °C で 20 時間増殖させた後、細胞新鮮重量 8 g を溶解し、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって分画しました (方法)。 共焦点および電子顕微鏡法によって検証されたように、C. Thermophilum 菌糸 (図 1C ～ G) にはミトコンドリアが豊富に含まれています (図 1C ～ G)。 ミトコンドリアは、予想される層状のリボン状のクリステを示し、断面で平行なスタックを形成します 17 (図 1F、G)。 豊富なミトコンドリア (図 1F、G) は、好熱菌の呼吸数の増加と一致しており 18、機能的な OGDHc がそのすべての既知のサブユニット (E1o) とともに豊富に存在するミトコンドリア活性が豊富な細胞抽出物を得る動機となっています。 、Ｅ２ｏ、Ｅ３）１９． ここでは、ウェスタンブロッティング（WB）によってすべての酵素の存在を確認し（図2A、補足図2A）、すべてのメタボロンの可溶性基質、つまりNAD +、α-ケトグルタル酸（α-KG）の定量的速度論的パラメーターの特徴付けを進めました。 ) およびコエンザイム A (CoA)。 OGDHc は、さまざまな補因子が関与する複数段階の反応を通じて、α-ケトグルタル酸 (α-KG) からスクシニル CoA への変換を触媒します (図 1B): チアミン二リン酸 (ThDP) は、E1o に共有結合したリポエートに結合します。 E2o のリポイル結合ドメイン (LD) であるのに対し、FAD は E3 のそれぞれの部位に結合します。 E1o と E2o はこの複合体に特有ですが、E3 はすべてのオキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体に共通しています。 分画内 KM 値は、それぞれ [149.80 ± 41.78] μΜ、[146.11 ± 46.15] μΜ、および [22.81 ± 11.93] μΜ で決定され (図 2B、補足図 2B、補足データ 1)、他の KM 値と比較できます。好熱性の対応物20、21。 好熱性真核生物由来の活性細胞抽出物の利点を正確に示すために、我々は特性評価を繰り返し、C. Thermophilum と S. cerevisiae 同等の抽出物の間の温度勾配における α-KG の反応速度の比較を実行しました (図. 2C、補足データ 1)。 得られたデータは、酵母同等サンプルの速度低下とは対照的に、C. サーモフィラム由来細胞抽出物の反応速度の増加を明らかに示しており、好熱性生物由来の細胞抽出物の構造解析への適合性を示しています。 我々の知る限り、単一の内因性検体における OGDHc のすべての基質の速度論的パラメーターの測定はこれまでに報告されていません。 私たちの結果は、将来のケト酸複合体の機能比較のベンチマークを設定します。 我々の発見は、単一細胞画分が速度論的に活性であり、その生化学的性質により拡張可能であり、さらなる精製や濃縮スキームを必要とせずに生成物形成に利用できることも示しています。 重要なのは、このような活性細胞抽出物はクライオ EM によって可視化され、活性複合体の構造理解を深められることです。

予想される分子量 (MW) でのネイティブ細胞抽出画分中のすべての OGDHc 成分の検出を示すウェスタンブロット。 低分子量画分をネガティブコントロールとして使用し、抗体の作成に使用した過剰発現タンパク質をポジティブコントロールとして使用しました。 E1o タンパク質のサイズが大きいため、この理由でフラグメントが使用されました (「方法」を参照)。 対応するバンドにはオレンジ色の矢印が付けられています。 B 天然 OGDHc の酵素的特徴付け。 それに応じて、α-ケトグルタル酸、NAD+、および CoA を各プロットに示す濃度で使用し、速度を 0 ～ 1 に正規化し、注釈付きのとおり、3 つの独立した生物学的複製のデータ ポイントに異なる記号で注釈を付けて各点を線で結んでいます。図パネル内。 C 酵母同等サンプルと比較した C. サーモフィラムの温度に対する反応速度の変化 (0 ～ 1 に正規化後) を表示するグラフ。フィギュアパネル。 プロットBおよびCに示されているKM値は、補足図2Bに示されているバーク・ラインウィーバープロットによって得られ、各グラフの灰色の背景と下部のグラフの黒いバーは、N = 3の独立した生物学的複製から導出された標準偏差を表しています。各レプリケートに 2 つの技術的重複が含まれます。 ここに示されるすべての値は補足データ 1 にリストされています。

OGDHc 代謝物を構造的に特徴付けるために、特徴付けられた活性抽出物の集中的なクライオ EM データ取得を実行しました。 E2o コアについて決定された構造は 3.35 Å の解像度に達し (補足​​図 3A、補足表 1)、de novo モデルの構築が可能になり、以前に報告された E2o コア 16 (補足図 3B) よりも解像度が大幅に向上しました。 EMマップ（図3A）は、三量体間および三量体内の界面（図3B）などの高次構造の特徴を表示し、二次構造要素を捕捉し、アミノ酸側鎖を正確に配置します（補足図3C）。 我々は、E2oの触媒活性部位を同定し、オキソ酸デヒドロゲナーゼ全体で保存されているCoA結合に関与するアミノ酸の側鎖立体構造を完全にモデル化することができた。 F247 は CoA を収容するために外向きの配向を持ち (図 3C)、π スタッキングを介して CoA 3',5'-アデノシン二リン酸基と相互作用して安定化します。 CoA のパント酸、β-アラニン、およびシステアミン成分の電子密度が限られていることが、内因的に結合した補酵素 A の固有の柔軟性の基礎となり、機能に影響を及ぼします 22。

A C. Thermophilum OGDHc E2o コアの 3.35 Å (0.143 FSC) クライオ EM マップ。 スケールバー: 5 nm。 B C. Thermophilum E2o コアの再構築モデル。クライオ EM マップに適合。 その下には、三量体間および三量体内の界面が単独で観察されます。 C E2o の CoA 結合領域と、その調整に関与する注釈付きのアミノ酸側鎖。 さらに、ポケット内の分解された密度は、結合した CoA に対応する可能性があります。 D E2o 頂点三量体の周囲の分解密度。結合した E2o リポイル ドメインに属する可能性があります。

別の密度がE2リポイル結合部位の近位で観察され、そこにE2o N-ter領域のリポイルドメイン(LD)が適合することができる(図3D)。 この観察は、以前に発表されたデータと一致しており、細菌の内因性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（PDHc）も立方体コア（界をまたがるケト酸複合体の特徴）を形成しており、同等の密度もLD23に起因すると考えられています。 結合した LD も、真核生物の PDHc E2 活性部位において同様の安定した構造で構造的に精製されました 24。 ここで示す真核生物の天然の活性型 OGDHc では、解像度は低下しますが、この密度は維持されており、LD は部分的に収容できます (図 3D)。 大きな違いは、すべてのLDがE2活性部位に結合した提案された休止状態に捕捉され得る細菌のPDHcと比較して、現在の真核生物のOGDHcは、LDが準化学量論的かつ一時的に存在する代替の休止状態を強調しているという事実にある。 E2 コアと対話します。 全体として、この OGDHc コア構造は、ネイティブ細胞抽出物で特徴付けられたタンパク質コミュニティ メンバーについてこれまでに報告された最高解像度の再構成を構成します。 明らかな高解像度の特徴に加えて、高次界面および LD/CoA 活性サイトは高解像度で定義されますが、その内因性の性質により、柔軟に結合した CoA および準化学量論的に結合した LD では低解像度の密度が表示されます。 。

OGDHc ジヒドロリポイルスクシニルトランスフェラーゼ (E2o) の再構成は、全体的なフォールドの点で、しかし局所的な適応という点で、ヒトの過剰発現された不活性な対応物との広範な類似性を強調しています (図 4)。 以前に公開された構造における E2o N-ter は特定の折り畳みを獲得しません (図 4A)。 対照的に、C.サーモフィラムでは、このエレメントはβストランド(E188～M194)構造を獲得し、残基N266～D282のβヘアピンモチーフとともに拡張されたβシートを形成します(図4B)。 この適応は、広範な水素結合を介してコアの安定化に寄与し、24量体立方体E2oコアの高次状態におけるサブユニット間のコミュニケーションに影響を与えます。 この折り畳みは、以前に発表されたヒトの対応物と比較した場合、E2oコア三量体の凝縮を課し、サブユニット間のより低い重心距離で翻訳されます（図4C、補足図4A）。 ヒト 10 および C. サーモフィラムの三量体間および三量体内界面のその後のエネルギーベースのスコアリング (補足図 4B、C、方法) は、ネイティブの好熱性 E2o 界面のスコアが一貫して高いことを示しています。 埋没表面積が、大きな構造変化を受けない生体分子複合体の実験的に測定された解離定数 (KD) に比例することを考慮すると 25、我々の結果は、C. Thermophilum E2o 酵素の結合がより強力であることを示唆しています。 この概念と一致して、C.サーモフィラムのサブユニット内およびサブユニット間の界面は、ヒトE2oコアの対応する界面よりも1.7倍および1.5倍大きく（補足図4B、C）、広範な電荷-電荷相互作用が含まれています（補足図4B、C）。 4B、C）。 前述の圧縮のもう 1 つの結果は、E2o N-ter LD の閉じ込めです。 逆平行βシートは、以前に解明されたループ構造と比較して、より安定性が高い26。 逆平行シートと混合シートは、歪み (ねじれや β バルジ) と溶剤への暴露の両方に耐えることができます。 したがって、新たに同定された構造要素は、2つの規則正しいE2oドメイン、すなわちE2コアを形成するスクシニルトランスフェラーゼと中間体を運ぶLDを接続する柔軟な領域によって探索される立体構造を抑制するためのアンカーポイントとして機能する可能性がある。

C. サーモフィラム E2o タンパク質 (オレンジ) とヒトの対応物 (シアン) を並べたもの。 顕著な違いには、C. サーモフィラム β ヘアピン モデルと C. サーモフィラム N-ter の β ストランド コンフォメーションの整列が向上する、より緊密なターン構造が含まれます。 B N266-D282 の β ヘアピン モチーフは、N ter β ストランド E188-M194 とともに、コアの全体的な安定性に寄与する β シートを形成します。 C 実験的に解明された C. Thermophilum E2o 三量体と比較したヒト E2o 頂点三量体の回転変位の概略図。中温性の対応物に対して「緩い」立体構造を示しています。

我々が捕捉した活性型OGDHc代謝物（図2B）における触媒作用（図1B）中、LDを保持する柔軟なE2oアームはスクシニル中間体をE1oからE2o活性部位に往復させ、E327によって再酸化される。 したがって、LD のリポイル化リジンは各酵素部位に妨げられずにアクセスできる必要があります。 これらの一時的な界面を構造的に特徴付けるために、3 つのメタボロンに埋め込まれたコンポーネント界面 (E1o-LD、E2o-LD、および E3-LD) の AlphaFold-Multimer モデリング 28 が実行されました。 3つの複合体すべてに対して生成されたモデル（図5A〜D、方法）は高品質であり、その予測された界面は実験誤差の範囲内で自信を持ってランク付けされています（補足図5A、B）。 さらに、(a) クライオ EM によって導出された E2o コアの近位密度における LD の適合 (図 3D) は、位置決めの点で AI によって予測されたもの (図 5B) と類似しています (b)生成されたすべての界面の補因子または活性部位までのリポイル化リジンの距離は10〜25Åの範囲にあります（補足図6A〜D）。 この範囲はリジン側鎖とリポエートの長さに対応し、最近の細菌の PDHc E2o-LD 界面でも観察されている相互作用タンパク質 15 の本質的な柔軟性も反映しています 24。 E1oは、2つのチアミン二リン酸（ThDP）と、E1o鎖間界面に局在する潜在的に2つのLD結合部位を有するホモ二量体（図5A）を形成します（図5A）。 α-ケトグルタル酸脱炭酸中にサクシニル化されるThDP C2原子までのリポイル化リジンの距離は生化学的に実現可能です（d = 14Å）（補足図6A）。 E2oはモノマーごとに単一のLDに結合し（図5B）、リポイル-リジンは結合したCoAの近位にあり、リジンCα-CoAチオール基の距離もd = 10Åです（補足図6B）。 最後に、E3 活性部位は、E3 媒介 LD 再酸化反応に関与する保存されたジスルフィド架橋とヒスチジンを近接して配置します 29,30,31。 AIベースのE3-LD複合体は、リポイル化リジンがE3活性部位のジスルフィド結合にアクセスするのに適切な距離にあることを示しています（d = 23Å）（補足図6D）。 E1o-LD複合体とE3-LD複合体の両方の2番目の代替立体構造モデルが生成されましたが（補足図5B、補足図6C、D）、活性代謝に必須の上記の生化学的制約を満たさなかったことに注意してください（図6） .2B）。

AI 由来の E1o-LD 相互作用モデル。 全体的なモデル、エネルギー学 (VdW ファン デル ワールス相互作用、DS 脱溶媒和エネルギー、ES 静電学)、埋め込み表面積 (BSA)、および LD との相互作用界面の全体的な電荷がそれぞれ左、中央、右に表示されます。 B AI 由来の E2o-LD 相互作用モデル。 全体のモデル、エネルギー論と埋没表面積、および LD との相互作用インターフェースの全体的な電荷が、それぞれ左、中央、右に表示されます。 C AI 由来の E3-LD 相互作用モデル。 全体のモデル、エネルギー論と埋没表面積、および LD との相互作用インターフェースの全体的な電荷が、それぞれ左、中央、右に表示されます。 D E2o の順序付けされた LD ドメインの AI 由来のモデル。 Lys42 はリポイル部分を保持しています。 高度に負に帯電した相互作用界面が観察できます。 プロットの元の値は補足データ 5 にあります。

生化学的 (E1o-LD、E2o-LD、および E3-LD) およびクライオ EM (E2o-LD) で検証された AI 生成メタボロン埋め込みインターフェースには、共通の特徴があり、それぞれをエネルギーベースの精製後に明らかになりました (図. 5A ～ C): すべての界面は、高いオン/オフ レートを持つ過渡界面の特徴的なエネルギー成分を構成する、同等の大きさの強力な静電相互作用によって支配されます (図 5A ～ C)。 相補静電現象（図 5D）は、「スイングアーム」機構 33 を介して中間体を往復する代謝物や、迅速なオン/オフ切り替えを必要とする他の代謝プロセスにおける集合的な特性です 34,35。 実際、静電ポテンシャルマップは、LD バインダーの広範囲の正に帯電した領域を強調しています (図 5D)。 これらの表面は、LD の負に帯電した表面を引き付けて収容し、全体として、「スイング アーム」機構を介して代謝チャネリングを達成するための重要な原理であるオキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体の構造的圧縮に寄与します 36。

より広範なプロテオームと活性抽出物内のその相互作用を解明するために、架橋剤濃度のベンチマークを行いながら、質量分析ベースの架橋実験を抽出物中で直接実行しました（方法）（補足図7A、B）。 全体的に、ペプチド回収レベル（方法）でのFDR 2％で、4949個の残基間架橋（3632個の残基内架橋および1317個の残基間架橋）を取得し、そのうち99.4％がC.サーモフィラムポリペプチド鎖にマッピングされました（補足データ） 2)。 合計 2091 のポリペプチド鎖のうち、505 のポリペプチド鎖が 2 つの生物学的複製と 2 つの技術的複製にわたって架橋されました (補足データ 2)。 これは、C. サーモフィラムの全プロテオームの 29.1% が、以前に記載されているものよりも大幅に大きい細胞コミュニティ 38 で組織化されていることを示しています 19。

ネットワーク分析により、1488 の特定されたメンバーが参加する多様な細胞コンパートメントから 54 の細胞コミュニティが特定されました (補足データ 2)。 コミュニティ全体のサブユニットのカバー率は高く (67% +/-24%)、完全な細胞質 (N = 128、サブユニットの 96%) およびミトコンドリア (N = 74、サブユニットの 99%) の翻訳装置などの例が含まれます。 さらに、一緒に架橋されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ/トリカルボン酸回路コミュニティのすべてのサブユニットを特定します (PDHc/TCA、N = 25、サブユニットの 100%、補足データ 2)。 PDHc/TCA コミュニティ内では、クロスリンクは 11 の関与酵素内および酵素間の相互作用を定義します (122 個の内部リンクと 169 個の相互リンク、補足データ 2)。 E3タンパク質は、実験で同定された最も多くの相互架橋を示し(N = 88)、他の7人のコミュニティメンバーの近くで見つかりました(図6A)。これは、ミトコンドリア代謝におけるその多様な役割を示しています。 E3タンパク質は、PDHc（E1p、E2p、E3BP）、OGDHc（E1o、E2o）のすべてのサブユニット、および仮説上のミトコンドリアヘム代謝39のサブユニットの近位空間位置を探索し、後者内で推定上のホロシトクロムcシンターゼ（HCC）と相互作用します（図6A）。 しかし、配列分析により、E3をOGDHc E2コア（残基M1〜T130）につなぐ、とらえどころのない真核生物のKGD4 OGHDcサブユニット12、13に対応する、HCC N末端での融合された誤注釈付きリボソームタンパク質が強調表示されました（補足図8）。 このN-terは、他の真核生物のKGD4と高い類似性を共有しています（補足図8）。 細胞画分にわたる MS データ 19 の再分析では、3 つの生物学的複製すべてにおいて、KGD4 と残りの OGDHc サブユニットの強力な共溶出が示されています (補足データ 2)。 その機能は本質的に PDHc E3BP と同じ (E3 を E2 コアに繋ぐ) ため、我々は共溶出タンパク質を C. サーモフィラム タンパク質 E3BPo と名付けました。

E3 の相互架橋により、多数の相互作用パートナーが明らかになります。 B OGDHc タンパク質の構成要素は高度に相互接続されています。 青色の線はタンパク質間架橋を表し、紫色の線はタンパク質内架橋を表します。

OGDHc 成分 (E1o、E2o、E3、E3BPo) では、44 個の分子間および 81 個の分子内固有の架橋が同定されました (図 6B)。 分子内架橋は、E1o、E2o、およびE3分子モデルをさらに裏付けます（補足図9A）。 詳細には、マッピングされた架橋の 92.3%、90%、および 100% が、E1o、E2o、および E3 でそれぞれ満たされています。 架橋距離の分布 (補足図 9A、補足データ 2) は、予想される対数正規距離分布 40 をさらに再現し、生化学的および構造的に検証された AI 由来モデルの品質を裏付けます。 物理的界面を形成することが知られていない酵素（E1o/E3; E3BPo/E1o）が依然として比較的近くに存在するため、分子間架橋は全体としてOGDHcの比較的コンパクトな状態を定義します（図6B）。 E1oおよびE3がE2oコアに相対的に近接していることは、一次配列のLDから下流に局在するE2のN-ter柔軟領域の関与を示している(図6B)。 この結果により、以前に検証されたLDとE1oおよびE3の相互作用モデルの架橋駆動による柔軟な分子ドッキングを利用して、LDによってサンプリングされた相互作用表面を解明することができました（図7A〜C）。

A LDとE10（上）およびLDとE3（下）の間の結合界面に関与する残基の頻度プロット。 B LD (ピンク) と E1o (灰色) の間の相互作用に関与する各残基の残基頻度は、LD をその結合ポケット (紫) に向けて配向する 2 つの間の「誘導」界面 (青) を明らかにします。 C LD (ピンク) と E3 (灰色) の間の相互作用に関与する各残基の残基頻度は、LD をその結合ポケット (紫) に向けて配向する 2 つの間の「誘導」界面 (青) を明らかにします。 プロットの元の値は補足データ 6 にあります。

我々は、タンパク質間相互作用における秩序ドメインに近位の無秩序領域への架橋マッピングを組み込むためにドッキングプロトコルを適応させた後、ドッキング結果からLD結合に関与するE1oまたはE3残基の頻度を計算しました（図7A）（方法、25）。 400 の明示的溶媒精製分子モデルから得られた LD 結合に関与する残基の上位 25% のマッピングは、LD が最終的にそれぞれの活性部位に結合するための明確な引力表面を示しています (図 7B、C)。 活性部位残基は、E1o (図 7B) と E3 (図 7C) の両方で頻繁に接触することが確認されていますが、E1o の吸着面は、E3 で計算されたものと比較して、回復されたホットスポットの点でより拡散しています。 (図7B、C)。 E1o における LD 結合のシグナル拡散がより高いことは、LD がかなり深く埋め込まれているため、近位表面が LD を E1o 結合ポケットに向かって誘導する可能性があることを示唆しています (図 7B)。 代わりに、E3の場合、「ガイド表面」は、平らなE3活性サイトから等辺に約5Å広がる狭い空間にはるかに限定されています（図7C）。 これらの結果は、LDの下流に位置する柔軟な領域によって支配される末梢E1oおよびE3サブユニットに対する異なるLD誘引機構を示している。

同定された内部架橋は、関与するタンパク質とそのAI由来の構造の存在を検証するだけでなく（補足図9A）、それらが多量体構造を形成していることも確認します。 E3BPo の内部架橋は同定されませんでした (図 6B)。これは、E3BPo がモノマーとして複合体の形成に関与していることを示している可能性があります。 E3BPo コピーごとに、単一の E3 がその柔軟な N-ter 領域を介して E2 コアにテザリングされます13。 PDHc14 に対して以前に行われたように、iBAQ スコアを定性的な化学量論データに変換すると、クライオ EM によって検証された 24 個の E2o サブユニットの正確な化学量論が示されます。 および<10 E10二量体、および〜4 E3BPoの相対化学量論、合計4つのE3二量体をつなぎます（補足図9B、C）。 E3はE2o無秩序領域およびその近位E2o LDドメインにも近接しているため、より多くのE3が収容できる可能性は十分にあります。 しかし、E2コアが最大48個の分子を動員し、合計96個のポリペプチド鎖（E2oモノマー24個と最大24個のE3BPoモノマー、それぞれが12個のE1oダイマーと12個のE3ダイマーを繋ぐ）の代謝を考慮すると、相対化学量論から末梢分子の準化学量論的組成が明らかになる。 OGDHcサブユニット。 これは、LD トラフィッキングに関与する未結合の柔軟な N-ter E2o コア領域の存在を示しています。

抽出物内の OGDHc の高次構造を解明するために、単一粒子データから非対称再構成を実行し、外部密度が見える 2D 投影を導き出しました (図 8A)。 これらの外部密度では、同定された E1o および E3 二量体が位置し、それぞれが E2o の N 末端の柔軟な領域 (図 6B)、または E3 の場合は柔軟な E3BPo (図 6B) のいずれかを介してつながれているはずです。 、13）。 クライオEMマップ（図8B）は21Åの解像度で決定され（補足図3B、補足表1）、E2oコアの周囲の密度を、拡散ではなくクラスター化して示しています（図8B）。 クライオ EM マップの密度閾値を増加させると、追加のより弱い密度が示されました (図 8B)。 C. Thermophilum の AlphaFold2 由来の E1o-LD および E3-LD モデル (図 8B、補足図 10A、B、補足データ 3) をクライオ EM マップに系統的に当てはめると、これらの分子の局在が解決され、それらの分子が存在することが示唆されました。コア密度上またはコア密度内ではなく、周辺部にあります。 さらに、マップ内の E1o と E3 の位置を再現する永続的なドッキング ソリューションは、高い相互相関値に関連付けられた体系的に適合した構造モデルから計算されました (補足データ 3、補足図 10A、B): 全体として、2 つの E1o と3 つの E3 二量体は、計算された外部密度内で分離できました。

OGDHc の 2D クラス平均は、高信号のコアを示し、その周囲にはより拡散した、しかし依然として明確な信号が周囲にあります。 スケールバー: 5 nm。 B OGDHc の非対称 3D 再構成は、E2o コアに対応する強い密度と、より弱い外部密度とより強い外部密度の混合を示します。 より強い密度では、E1o および E3 二量体は高い信頼性で局在化できます。 スケールバー: 10 nm。

係留されたE1oおよびE3酵素はE2oコアに近接して非対称に分布しているが、コア自体からはほぼ等しい距離を保っている(図8B)。 OGDHcのテザリング領域の固有の柔軟性は、さまざまなカテゴリの柔軟なタンパク質領域の物理化学的または統計的計算と一致しません（たとえば、IDP、溶融小球、完全に拡張した;補足図10C）。 私たちが導出した3D再構築で測定したE2oリンカーの長さによると（図9A、補足図10C）、OGDHc柔軟領域は、「伸長した」IDP（MarshおよびForman-Kay41で定義されているIDP）と「くびれのある」リンカー (George と Heringa42 によって定義)。 柔軟な領域によって媒介される順序付けされた OGDHc 参加酵素間で測定された距離が利用可能な構造データで再現できるかどうかを解明するために、分解されているが、分解されていないストレッチのために配列的にさらに離れているアミノ酸残基の距離を計算しました。構造データ。 この未解決のストレッチの存在については、さまざまな技術的理由が考えられますが、構造的障害の指標である可能性もあります 43。 2022 年 6 月時点のすべての Protein Data Bank (PDB)44 構造データ (191,144 構造) を分析した結果、「欠落している」ストレッチの前後にある順序付けされた残基間の距離が劇的に限定されていることがわかります (図 9A)。 これは、PDB 内の現在の構造データには、我々の結果で報告されている種類の相互作用がほとんど含まれていないことを意味します (図 8B、図 9A)。 25アミノ酸残基を超えるポリペプチドストレッチが存在しない場合の計算された距離の相対的な「平坦化」は明らかであり（図9A）、報告された最大Ca-Ca距離は平均約30Åであり、OGDHc代謝におけるものよりも実質的に短い。 。

PDB に登録されているすべてのタンパク質構造に属するすべての未解決のアミノ酸配列のビン化されたグループの平均距離値を表すグラフ。 プロットの凡例に示されているように、黒い点はアミノ酸グループの長さの平均値を表し、灰色のさまざまなスケールは、全データの各四分位を統合した後の標準偏差を表します。 赤い線は、アミノ酸グループの距離と長さの関係を表す近似モデルを表します。 薄緑色は、E2oの分離されたコアドメインのN末端と、周辺部で適合したE1o二量体に結合するLDのC末端との間の実験的に測定された平均距離を示し、一方、濃い緑色は、実験的に測定された同じ平均距離を表す。 E2o の分離されたコアドメインの N-ter と、適合した E3 二量体に結合した LD の C-ter の間で測定されます。 青い線はアミノ酸配列の理論上の距離を表し、青い破線はアミノ酸配列の理論的な下限を表します。 B 解明された OGDHc の末梢サブユニット組織の概略図。 C OGDHc の組織に関するすべての新しい観察を説明するモデル。 E2o コア頂点三量体の N-ter β シート構造は、24 mer E2o コアの安定化とコンパクト化を促進すると同時に、LD ドメインを接続する柔軟なリンカーの配向を制御します。 架橋データは、柔軟なリンカーと周辺サブユニットの間のかなり安定した相互作用を明らかにし、おそらく、負荷されていない LD ドメインの構造的役割を示唆し、一方、負荷された別の LD ドメインが反応サイクルを実行します。 LD と周辺サブユニット間の相互作用は、強い静電力によって支配されます。

我々の知見を総合すると、スクシニルCoA産生細胞抽出物との関連でオキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の提案された構造についての我々の理解がさらに広がる(図9B、C)。 この複合体のコアは、頂点を構成する E2o 三量体がマルチサブユニット二次構造要素 (コア ドメイン N ター β シート) の助けを借りて高密度に詰め込まれた堅牢な立方体超構造です。 この高密度のコアパッキングは、関連するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の場合に以前に示されたように、好熱性への適応であるか、または内在性 OGDHc の一般的な特徴である可能性があります。 ただし、OGDHc は PDHc と類似していると考えられていますが、内在性 E2 N-ter 立体構造は異なります。OGDHc では、E2 N-ter は鎖間 β シートの一部である β 鎖立体構造で折り畳まれています。 内因性 PDHc では、この N-ter 要素は柔軟です。 このような構造的適応は、オキソ酸デヒドロゲナーゼの異なる E2 コアへの明確に負荷された LD の結合の特異性決定因子の可能性についての我々の見解を拡張します。

我々が導き出したもう一つの観察は、同じ構造要素が、反応に関与する連続した活性部位を横切る基質の輸送に重要なドメインであるLDドメインを繋ぐ伸長N末端柔軟リンカーの利用可能なスペースを制限しているということである。 LD-E1o 相互作用の場合は約 50 ～ 100 Å、LD-E3 相互作用の場合は 60 ～ 70 Å です。 また、静電相補性が LD のさまざまな結合剤 (E1o、E2o、E3) への結合を促進することにも注目してください。 我々のXL-MSデータに基づくと、E2oの柔軟なリンカーとLDは、E2o N末端配列に特定の末梢サブユニット結合ドメインが存在しない場合に、E1oおよびE3サブユニットを維持する「アンカー」としても機能する可能性がある。 E2o コアに近接しています。 E1o の無秩序な N-ter ドメインは、E1o-LD 結合部位と相互作用することが最近解明され 45、代謝内の他の LD 結合界面と相互作用することにより、E2o コアの近くで E1o を組織化するのにさらに役立つ可能性があります。 E1oとE3はどちらもホモ二量体であり、二重のLD結合部位を含んでおり、一方が反応において積極的な役割を果たし、他方は近位の「負荷のない」LDドメインとの高電荷の相補的な静電結合を維持できることを示唆している。 この「アンロードされた」LD ドメインは「アンカー」として関与している可能性があり、おそらく、柔軟なリンカーと周辺サブユニットの表面残基および同定された E3BPo タンパク質との他の弱い相互作用によって補助されている可能性があり、これも整理するための XL-MS データにキャプチャされています。 E3タンパク質。 追加の LD ドメインの「構造的」役割は、ここで示した MS データによって定量化された、コア E2o サブユニットと周辺 E1o-E3-E3BPo サブユニット間の準化学量論的関係によって示唆されることもあります。 分子生物学的手法を組み合わせて E1o、E3、E3BPo サブユニットを過剰発現し、OGDHc を含む細胞抽出画分との混合実験を行うことで、化学量論の相互作用、相互作用、代謝分子構造の適応についてより深い洞察を得ることができる可能性があります。 この研究は、抽出物中の化学量論、したがって濃度を正確に決定するための標識ペプチドを用いた定量的プロテオミクスによって支援され、クライオEMによるOGDHcの機能を理解するための重要な材料を提供するであろう。

全体として、この研究では、スクシニル CoA 生成能力を持つ細胞抽出物の完全な内容を特徴付け、反応の主要なプレーヤーである OGDHc とその構成要素である E1o、E2o、E3、E3BPo の生化学的機能と新規構造的特徴を解明しました。 。 私たちの研究により、対処する必要がある疑問が生じます。存在する複数のタンパク質コミュニティ間には分数間の相互作用はあるのでしょうか? それらの生化学的および構造的関係はどのように特徴づけられるのでしょうか? これらの質問は、完全に高密度で架橋された細胞抽出物の自動化されたハイスループットのクライオ EM を採用し、より大規模なデータ収集と組み合わせて、複雑な柔軟性と相対的に少ない個々の元素の問題に取り組むことによってのみ答えることができます。 。 計測器46、データ収集47、分析48,49の進歩、および正確なAI主導モデリング50の出現により、ネイティブ細胞抽出物の特性評価の合理化が可能になります。 近い将来、私たちのアプローチは、まだ解明されていない他の細胞代謝物に関連した酵素分析の新しいパラダイムにつながる可能性があります。

チェトミウム・サーモフィラム var. Thermophilum La Touche 1950 (Thermochaetoides Thermophila51) は DSMZ (ドイツ、ライプニッツ研究所 DSMZ-ドイツ微生物および細胞培養コレクション) から入手し、凍結乾燥アンプルに保存された胞子は会社のガイドライン (DSMZ Media list Medium 188) の指示に従って培養されました。 、温度：45℃）。 最初の培養後、菌糸体は、ddH2O 1,000 mL あたり、トリプトン 5.00 g、ペプトン 1.00 g、酵母エキス 1.00 g、デキストリン 15.00 g、スクロース 3.00 g、MgSO4 0.50 g × 7 を含む液体完全培養培地 (CCM) で増殖しました。 H2O、0.50 g NaCl、0.65 g K2HPO4 × 3 H2O および 0.01 g Fe2(SO4)3 × H2O。 CCMの最終pHを7.1に調整した。 最終培養は次のように実施しました: 固体培地プレート培養: 液体 CCM に 15.00 g の寒天/1000 mL ddH2O を補充し、その後プレートに菌糸体を接種し、54 °C で増殖させました。 液体培地培養: 2000 mL 三角フラスコに液体 CCM 培地を総容量 (800 mL) の 40% まで満たし、寒天プレートから新しく成長させた菌糸体の小片を加え、110 rpm、10% CO2 で振盪しながら 20 分間インキュベートしました。 h.

蛍光顕微鏡イメージングは​​次のように実行されました。浸漬なしの 40X 対物レンズ (plan-Apochromat 40X/0.95 NA) を備えた Zeiss LSM880 (Carl Zeiss、ドイツ) を使用してサンプルをイメージングし、画像は ZEN Black 画像解析ソフトウェアで取得しました。 （カールツァイス、ドイツ）。 FM 4-64 (ThermoFisher Scientific、米国) による膜染色の場合、色素を DMSO でストック濃度 10 mM に希釈しました。 次いで、１μＬのストック溶液を１ｍＬのＣ．サーモフィラム液体細胞培養物に添加し、１０μＭの作業濃度に達した。 サンプルは 2 ～ 3 分間のインキュベーション時間後に画像化されました。 MitoTracker orange (ThermoFisher Scientific、米国) を使用したミトコンドリア染色の場合、色素を DMSO でストック濃度 10 μM に希釈しました。 次いで、５μＬのストック溶液を１ｍｌのＣ．サーモフィラム液体細胞培養物に添加し、５０ｎＭの作業濃度に達した。 サンプルは 10 分間のインキュベーション時間後に画像化されました。 透過型電子顕微鏡 (TEM) イメージングは​​以下のように実行されました: 新たに増殖させた液体培養 C. サーモフィラム フィラメントを、0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (SCP; pH 7.2) 中の 3% グルタルアルデヒド (Sigma、タウフキルヒェン、ドイツ) で室温で 5 時間固定しました。温度。 固定後、サンプルを SCP ですすぎ、SCP 中の 1% 四酸化オスミウム (Roth、カールスルーエ、ドイツ) で室温で 1 時間後固定しました。 続いて、サンプルを水ですすぎ、段階的エタノールシリーズで脱水し、Spurr (1969)52 に従ってエポキシ樹脂を浸透させ、70 °C で 24 時間重合させ、次に Ultracut S ウルトラミクロトームで 70 nm の超薄切片に切断しました。 （ライカ、ドイツ）。 切断後、切片をホルムバールコーティングを施した銅グリッド上に適用し、専用の EM 染色装置 (ライカ、ドイツ) での後染色のために酢酸ウラニルとクエン酸鉛を添加しました。 イメージングには、80 keV で動作する Zeiss EM 900 TEM (Carl Zeiss、ドイツ) を使用しました。 すべての画像処理は、Fiji ソフトウェアを使用して実行されました53。

細胞抽出物を調製するために、慎重に成長させた菌糸体 15 を孔径 180 μm のふるいを使用して単離し、PBS で 3000 × g、4 分間、4 °C で 3 回洗浄しました。 残留水分を除去した後、液体 N2 で事前に冷却した乳鉢を使用してペレットを凍結粉砕し、後で使用するために -80 °C で保管しました。 約 8 g の凍結粉砕物質を 20 mL の溶解緩衝液 (100 mM HEPES pH 7.4、5 mM KCl、95 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM DTT、5% グリセロール、0.5 mM EDTA、Pefabloc 2.5) に溶解しました。 mM、ベスタチン 130 μM、10 μg mL-1 DNAse、E-64 40 μM、アプロチニン 0.5 μM、ペプスタチン A 60 μM、ロイペプチン 1 μM)、6.5 mps の振盪速度を 25 秒間 3 回繰り返し、4 ℃ Fastprep 細胞ホモジナイザーを使用し、各繰り返し後に氷中で 3 分間休ませます。 4000 × g の遠心分離ステップを使用して大きな細胞破片をペレット化し、次に 100,000 × g の高速遠心分離を実行しました。 得られた上清を100 KDaカットオフ遠心フィルターで濾過し、30 mg・mL-1まで濃縮した。

濾過し、30 mg・mL-1 に濃縮した上清を、500 μL ループを介して ÄKTA Pure 25 M FPLC (Cytiva, USA) システムに取り付けられた Biosep SEC-S4000 サイズ排除カラムにアプライしました。 サンプルを適用する前に、カラムを、pH 7.4の200 mMのCH3COO-NH4+を含む濾過し、脱気した緩衝液で平衡化した。 画分容量を250μL、流速を0.15mL・min-1に設定した。 取得した MS データ (以下の詳細を参照) に基づいて、スクシニル CoA 産生細胞抽出物としての適合性を試験するために画分 6 を選択しました。

酵素活性比較用の同等の酵母サンプルを作製するために、ATCC (American Type Culture Collection PO Box 1549 Manassas, VA 20108 USA; ATCC® 24657TM) の Saccharomyces cerevisiae 株を YPDG 培地中で 30 °C で 5 時間培養しました。 OD595 が 2.5（初期指数関数期）になるまで回収し、4 °C、3000 × g で 5 分間回収し、蒸留水で洗浄しました（得られたペレット約 7 g）。 最終サンプル調製までのその後のプロトコールは、上記の C.thermophilum 調製と同じです。

OGDH 活性アッセイは 54 から採用されました。 酵素アッセイは、100 mM NaCl、30 mM K2HPO4 (pH 7.5)、2 mM MgCl2、2 mM ThDP、4 mM α-ケトグルタル酸、3 mM NAD+、0.4 mM を含む 4 °C の反応容量 100 μL で調製しました。 CoA、4 µL Cell Counting Kit 8、および OGDH を含む 2 µL 細胞ライセート。 KM 計算では、α-ケトグルタル酸を 50 ～ 5000 μM、NAD+ を 25 ～ 5000 μM、CoA を 5 ～ 1000 μM に滴定しました。 反応混合物 (α-ケトグルタル酸を含まない) を、基質 KM 計算の場合は 37 °C で 5 分間、温度依存性の速度論的特性評価の場合は 5 °C 間隔で 25 °C ～ 65 °C でプレインキュベートし、反応を開始しました。 α-ケトグルタル酸の添加により。 Cell counting kit 8 の WST-8 によるホルマザン生成物の形成を 460 nm で 1 時間毎分監視し、Lambert-Beer 方程式と WST-855 のモル吸光係数 (ε = 3.07 × 104 M) を使用して濃度を計算しました。 −1cm−1）。 基質過剰阻害のため、二重逆数 Lineweaver-Burk プロット 56 を使用して反応速度を基質濃度に対してプロットし、漸近線形回帰の横座標の交点で KM 値を決定しました。

ウェスタンブロッティング (WB) 実験では、社内でキャストした新たに調製した厚さ 1 mm のゲルを次の組成で使用しました: 分離相: 370 mM Tris-HCl pH 8.8、10% w/v アクリルアミド (37.5:1)、 0.04% w/v APS、0.002% v/v TEMED、0.1% w/v ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) in ddH2O、スタッキング相: 125 mM Tris-HCl pH 6.8、5% w/v アクリルアミド (37.5:1) 、0.04% w/v APS、0.002% v/v TEMED、ddH2O中0.1% w/v SDS。 サンプルは事前に 4x ローディング色素 (250 mM Tris-HCl pH 6.8、40% v/v グリセロール、20% v/v β-メルカプトエタノール、0.2% w/v ブロモフェノール ブルー、8% w/v SDS) と混合し、次に 100 °C で 5 分間インキュベートします。 各ネイティブサンプルについて、約 400 ng のタンパク質を各レーンにロードし、5 μL の Precision Plus Protein™ All Blue Prestained Protein Standards (Biorad、USA) をマーカーとして各ゲルにロードしました。 組換え対照サンプルの濃度は約 8 ng でした。 ローディング後、100 Vの電場を1.5時間印加して、10×ストック（ddH2O中グリシン144 g、トリス塩基30.3 g）から新たに希釈した1×電気泳動緩衝液中でゲル電気泳動を行った。 Trans-Blot® Turbo Transfer System (Biorad、米国) を使用して、事前設定された 25 V (1 A) 印加電場でゲル内容物をニトロセルロース膜に 20 分間転写しました。 5% w/v TBST/牛乳溶液中で一定に撹拌しながらブロッキングを 1 時間実行し、その後メンブレンを一次抗体とともに 4 °C で 16 時間インキュベートしました (適用したすべての抗体濃度は 0.2 μg・mL に調整しました)。 1、2% w/v TBST/牛乳)。 一次抗体を除去し、2% w/v TBST/牛乳による 3 回の洗浄ステップを続けました。 次いで、膜を二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG、Abcam、ab205718、0.1μg・mL-1、2% w/v TBST/ミルク)とともに1時間インキュベートした。 さらに 2% w/v TBST/ミルクによる 3 回の洗浄ステップを適用し、最後に ChemiDoc MP イメージング システム (Biorad、米国) と新たに混合した ECL 蛍光混合物および最適な露光時間を用いて膜をスクリーニングしました。 すべての一次抗体は GenScript (ニュージャージー州、米国) によってカスタマイズされており、抗体の生成に使用された抗原配列はここに記載されています: (a) E1o α/β タンパク質には、Met-E1o611-818-His6 と a分子量 (MW) 24,014.67 Da。 (b) E2o タンパク質は Met-E2o39-420-His6 にまたがる組換え配列を有し、分子量は 42,485.91 Da です。 (c) E3 α/β タンパク質は、Met-E335-504-His6 にまたがる組換え配列を有し、MW は 51,341.91 Da です。

スクシニル CoA 産生細胞抽出物の構造特性評価のため、最終タンパク質濃度 0.3 mg・mL-1 のサンプル 3.5 μL を、200 メッシュ銅グリッド上の炭素コーティングされた穴あき支持フィルム R2/1 タイプ（Quantifoil、これは、以下の条件下で事前にグロー放電されました: PELCO easiGlow (TED PELLA、米国) を使用して、15 mA、グリッドマイナス、0.4 mbar、および 25 秒の発光時間。 次に、Vitrobot® 濾紙 (グレード 595 無灰濾紙 ø55/20 mm) でブロッティングした後、グリッドを Vitrobot® Mark IV システム (ThermoFisher Scientific、米国) でプランジ凍結しました。 チャンバー内の条件は 4 °C、湿度 95% で安定し、ブロッティング パラメータはブロット力 0、ブロッティング時間 6 秒に設定されました。 ガラス化されたグリッドを切り取って、低温および低湿度条件下でGlacios 200 keV低温透過型電子顕微鏡(ThermoFisher Scientific、米国)にロードしました。 画像は、Falcon 3EC 直接電子検出器および EPU ソフトウェア (ThermoFisher Scientific、米国) を使用して、線形モードおよび総電子線量 30 e-/Å2 で取得しました。 取得前に、ビームは直径 2.5 μm でサンプルに対して平行および垂直になるように調整されましたが、100 μm の対物絞りにより対物角度が制限されました。 完全な取得パラメータは補足表 1 にリストされています。

画像処理のすべてのステップは、cryoSPARC ハイパフォーマンス コンピューティング ソフトウェア バージョン 3.3.157 を使用して実行されました。 25,803 本の映画のデータセットが専用のワークスペースにインポートされました。 ソフトウェア内パッチ動き補正 (マルチ) およびパッチ CTF 推定 (マルチ) アルゴリズムを使用して、ビーム誘発動きを補正し、顕微鏡写真の CTF パラメーターをそれぞれ計算しました。 データセットのキュレーション後、画像解析プロセスの後続のステップのために 24,300 枚の顕微鏡写真が選択されました。 テンプレートは、テンプレート作成ジョブ (等間隔に生成された 20 個のテンプレート) を使用して EMD-1384416 から作成され、テンプレート ピッカーを使用したピッキング ジョブに使用されました。その結果、208 ピクセルのボックス サイズで抽出された 3,596,302 粒子の初期データセットが得られました。 。 次に、リファレンスフリーの 2D が 200 のクラスに分類されます。 最初の 2D 分類から 4 つのクラスから 71,912 個の粒子が選択され、不均一な精製が行われ、異常な形成の OGDHc E2o コア構造となった粒子を破棄した後、最終的な粒子セットは 52,034 個の粒子にさらに精製されました。 その後、最終的な粒子セットは八面体 (O) 対称で対称拡張され、ローカル リファインメント (新しい) ジョブによる最終的なコア再構成に使用され、その結果、解像度 3.35 Å (ゴールドスタンダード FSC 基準 0.143) の OGDHc E2o コア マップが得られました。補足図3A）。 完全な OGDH 複合体の再構成では、コアの周辺に位置するサブユニットのシグナルを含めるために、コア再構成に含まれる 71,912 個の粒子が 288 ピクセルのより大きなボックス サイズで再抽出されました。 次に、それらは 20 の 2D クラスに再分類され、最も顕著な周辺密度を示したクラスが新しいラウンドのテンプレート選択のテンプレートとして再び使用され、2,891,518 個の単一粒子の初期粒子セットが得られました。 この粒子セットはさらに 3 ラウンドの 2D 分類を受け、常に堅牢なコア信号を表示するクラス平均を基準に選択されましたが、コアに加えて周辺サブユニット信号も表示され、最終的に 3D 分類に使用された 52,551 個の粒子セットになりました。 10クラスのジョブ。 5178個の粒子を含み、最もよく分解された周辺密度を表示するクラス0は、最終的に均質な精製に使用され、21.04Åの分解能（ゴールドスタンダードFSC基準0.143）のOGDHcマップが得られました（補足図9D）。あらゆる構造解析に。 すべてのマップの視覚化は、ChimeraX58 ソフトウェア パッケージを使用して実行されました。

E2o コア構造の改良では、ChimeraX を使用して初期モデル (PDB ID: 7Q5Q) をクライオ EM 密度に適合させた後、Coot59 による反復手動改良と標準パラメーターを使用した Phenix60 による実空間改良を使用して改良しました。 マッピングできる可視密度は、M195 から E188 まで、E2o の N 末端に向かって拡張されました。

AlphaFold-Multimer28 のローカル インストールは、実験的に導出されたマップでモデル化された E2o コア頂点三量体、E1o ダイマー (Uniprot ID: G0RZ09) および E3 ダイマー (Uniprot ID: G0SB20) の予測を実行するために利用されました。 Uniprot アノテーション付き E2o LD ドメイン (残基番号 40 ～ 115、Uniprot ID: G0SAX9)。 すべての AlphaFold2 ベースの品質メトリクス (予測整列誤差 (PAE) および予測ローカル距離差分テスト (plDDT)) は、補足図 5A、B にあります。すべての静電表面を計算および視覚化するために、APBS 静電プラグイン 61 が使用されました。 PyMol (シュレディンガー、米国)。

報告された HADDOCK2.2 計算には 2 つの異なるプロトコルが適用されました: (a) HADDOCK 改良62。 ここでは、改良プロトコルを適用して、OGDHc コンポーネントとそのヒトホモログの間の界面、および LD によって形成される AlphaFold2 生成界面のエネルギー論を計算および比較しました。 この精製手順では、HADDOCK プロトコルの水精製段階のみが実行され、計算されたエネルギーと一過性のタンパク質間相互作用 25 の結合親和性が定性的に相関することが示され、ドッキングステップをスキップしました。 このために、複合体は TIP3P 水の 8 Å シェル内で溶媒和されました。 プロトコルは以下のステップで構成されました: (1) タンパク質を固定した 40 EM ステップ (パウエル ミニマイザー)、および (2) タンパク質の調和位置拘束を伴う 2 × 40 EM ステップ (k = 20 kcal・mol−1 Å−2) ）。 最終的な水の精製では、ステップ (2) の後に、デカルト空間での分子動力学を使用した穏やかな模擬アニーリング プロトコルが導入されます。 (1) 加熱期間: 100、200、および 300 K で 500 MD ステップ。位置拘束 (k = 5 kcal・mol−1 Å−2) が、界面の側鎖を除くタンパク質に適用されます。 。 (2) サンプリングステージ: 1250 MD ステップ。 弱い（k = 1 kcal・mol−1 Å−2）位置拘束が、主鎖と界面の側鎖を除いてタンパク質に適用されます。 (3) 冷却段階: 300、200、および 100 K で 500 MD ステップ。弱い (k = 1 kcal・mol−1 Å−2) 位置拘束は、界面を除くタンパク質主鎖にのみ適用されます。 運動方程式の積分には 2 fs のタイム ステップが使用され、Berendsen サーモスタット 63 を使用した基準温度バスへの弱結合によって温度が一定に維持されます。 計算はCNS64で実行されました。 非結合相互作用は、カットオフ 8.5 Å を使用して OPLS 力場 65 で計算されました。 静電ポテンシャル (Eelec) はシフト関数を使用して計算され、スイッチング関数 (6.5 ～ 8.5 Å) を使用してファン デル ワールス ポテンシャル (Evdw) が定義されました。 構造計算は、リファインメント インターフェイスを使用して、https://alcazar.science.uu.nl/ にある HADDOCK Web サーバーで実行されました。 各複合体に対して合計 200 の構造が生成されました。 (b) HADDOCK フレキシブル ドッキング。 guru インターフェイスを利用して、HADDOCK ドッキング サーバーが使用されました。 ここでは、LD と E1、および E3 の LYS 残基に一致する導出された架橋データをそれぞれ適用することにより、距離制約が使用されました。 適用される距離制限は、この記事で提供される haddockparam.web ファイルに含まれています。 ドッキング計算には、デフォルトで guru インターフェイスが使用されましたが、検索およびスコアリングのスペースが大幅に拡張されました。 これは、生成された構造が N = 10,000 に増加し、スコア付けされた構造が N = 400 に増加したことを意味します。LD の結合に関与する頻度の高いアミノ酸残基の計算は、N = 400 の最終的な水からの形成された界面から生成されました。洗練されたドッキング ソリューション。 界面残留物は、LD の他の残留物から 5 Å 以内にある場合に考慮されます。 報告される頻度の高い残基は、計算された残基ごとの頻度の上位 4 分の 1 (25% 以上) に属する残基であり、これらは BoxPlotR オンライン Web サーバー 66 を使用してプロットされました。

クライオ EM 実験データから生成された OGDHc 複合マップを使用して、AlphaFold-Multimer 予測によって生成された E2o LD ドメインと複合した末梢 E1o および E3 サブユニットの配置を次のように特定しました。マップは表示されました。 ChimeraX では、E2o コアを中心にフィットさせた後、セグメント マップ ツールを使用して「コア」領域と「外部」密度領域にセグメント化しました。 次に、E1o-LD および E3-LD 複合体の両方に対して 100 回のフィット検索を実行し、各フィットの相互相関 (CC) 値をリストし、コアまたは外部密度領域のフィッティングとして分離しました。 統計的有意性については、2 つの CC フィット グループを Microsoft Excel (Microsoft Corporation、USA) の分析ツールパックを使用した単一因子分散分析 (ANOVA) でテストしました。フィットの値は補足図 10A、B、および補足データ 3. CC プロットは、BoxPlotR オンライン Web サーバーを使用してプロットされました。

C. Thermophilum E2o リンカー距離の計算は次のように実行されました。 (a) 実験的に分解された距離測定では、結合した LD を持つすべての周辺サブユニットを OGDH 複合体マップに適合させた後、ChimeraX の「距離」コマンドを使用して距離を測定しました。視覚的に検査された最も近い E2o コア頂点三量体の 3 つの E2o サブユニットのそれぞれの最後に分離された N-ter 残基から、周辺部の E1o または E3 二量体のいずれかに結合したモデル化された LD ドメインの最初の C-ter 残基まで。 その後、すべての値が平均され、計算された個々の測定値と標準偏差は補足データ 3 に示されています。その後、不規則なリンカー長 (73 aa、Uniprot ID: G0SAX9) に基づく理論計算は、Marsh および Forman-Kay によって公開された導出方程式に基づいていました 41 、Wilkins et al.67、George と Heringa42。 さらに、PDB から実験的に解析された構造に基づいて不規則なリンカーの長さに関する洞察をさらに引き出すために、2022 年 6 月 1 日時点で完全な PDB データベースがダウンロードされ、50 万以上の鎖を含む合計 191,144 mmCIF 形式のファイルがダウンロードされました。分析されました。 欠落しているリンカー領域とその対応する配列は、mmCIF ファイルの「_pdbx_unobs_or_zero_occ_residues」エントリから特定され、合計 399,404 の欠落領域が記録されました。 欠落領域エントリごとに、mmCIF ファイル内の原子座標データを使用して、観察された左右のアミノ酸が特定されます。 すべてのリンカー領域について、次の特性が導出されます。(a) 観察された 2 つの残基間の末端間の Ca-Ca 距離 (Å 単位で測定)、(b) リンカー領域の長さ、および (c) リンカー領域の配列。リンカー領域。 これらの欠損領域の長さは1アミノ酸から最大3736アミノ酸まで変化し、リンカー配列の長さが増加すると利用可能なPDBエントリーの急激な減少が観察され、その傾向は補足図10Eに見られます。 より良い集合的特性を引き出すために、アミノ酸の長さのビン幅を適応的に増加させることによってファイルがグループ化されました。 1 ～ 50 アミノ酸の場合、ビン幅は 1 に保たれます。50 以降では、右側のビンの端が 55、60、65、70、75、100、125、150、250、4000 と徐々に増加します。エントリよりすべてのビンに含まれる Ca-Ca 距離の平均値が計算され、分位数での距離は 0.0 から 1.0 まで 0.2 刻みで変化しました。 分析されたデータは補足データ 4 に示されています。図 9A では、黒い点で表される平均 Ca-Ca 距離がリンカー領域の長さに対してプロットされました。 凡例に注釈が付けられているように、分位点レベル (0.0 ～ 1.0) での距離が色の濃淡としてプロットされました。 参考のために、3.5 Å に対応する水平線 (青色の点線) をプロットしました。 同様に、欠損領域の長さの 7 倍に相当する線 (青の実線) がプロットされました。 平均 Ca-Ca 距離 (y) と欠損配列のアミノ酸数 (x) の関係は、\(y=A\left(1-{e}) の形式のモデル関数によって経験的に特徴付けることができます。 ^{-{bx}}\right)+3.5\)、ここで、定数 A と b の値はそれぞれ 11 と 0.2 であることがわかります。 モデル関数は赤い線としてプロットされました。 PDB 距離計算に関連するすべてのプロット (図 9A、補足図 10D、E) は、Python 3.9 の Pandas パッケージを使用して生成されました。 すべての理論的および実験的距離計算を含むバブル プロット (補足図 10C) は、R の ggpubr 0.4.0 パッケージを使用して生成されました。

ホモ・サピエンス E2o 頂点三量体サブユニットと実験的に解析された C. サーモフィラム E2o 頂点三量体サブユニット (A、B、C) の回転変位計算は次のように実行されました。まず、C. サーモフィラムとホモフィア・サピエンス (PDB ID: 6H05) ) E2o 三量体が抽出され、PyMol のサブユニット A 上に整列されました。 次に、「angle_between_domains」コマンドを使用して、まず C. サーモフィラム サブユニット A と B の間の角度を計算しました。C. サーモフィラム サブユニット A と H. サピエンス サブユニット B の間の角度についても同じことが行われました。次に、値が減算されました。 同じプロセスをサブユニットのペア A と C に対しても実行し、回転軸を同じに保ち、サブユニット A に合わせました。測定されたドメインの視覚的表現を補足の図 4A に示します。

上記の C. Thermophilum ネイティブ ライセート分画からの画分 3 ～ 9 を 2 つのプール (3 ～ 6 および 7 ～ 9) にプールしました。 各プールから 40 μL のサンプルを、以前に記載されているようにトリプシンを用いて溶液中で消化しました 68,69。 サンプルの還元およびアルキル化中のタンパク質の沈殿を避けるために、20% SDS 2 μL を添加しました。 200 mM HEPES/NaOH pH 8.5中の200 mM DTT 1 μLを加えてタンパク質サンプルを還元し、その後56℃で30分間インキュベートしました。 還元後、アルキル化した後、200 mM HEPES/NaOH、pH 8.5中の400 mM クロロアセトアミド2 μLを添加し、さらに25℃で30分間インキュベートした。 HEPES/NaOH、pH 8.5中の200mM DTT 2μLを添加することにより、過剰のクロロアセトアミドをすべてクエンチした。 還元とアルキル化の後、サンプルはシングルポット固相強化サンプル調製に使用されました 68,69。 この調製では、5 μL の 10% v/v ギ酸と 2 μL の Sera-Mag ビーズを、最終 ACN パーセンテージ 50% v/v を達成するのに十分な量のアセトニトリル (ACN) とともに添加しました。磁気ラック上での 1 分間のインキュベーションとビーズの捕捉。 次いで、ビーズを２００μＬの７０％エタノールを添加して２回洗浄し、２００μＬのＡＣＮでもう１回洗浄した。 10μLの100mM HEPES/NaOH、pH8.5中の0.8μgの配列決定グレード修飾トリプシン10μLに再懸濁した後、ビーズを37℃で一晩インキュベートした。 インキュベーションの後に逆相クリーンアップステップが続き、Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 質量分析計 (ThermoFisher Scientific、米国) を使用したタンデム質量分析計 (LC-MS/MS) と組み合わせた液体クロマトグラフィーによって分析しました。 より具体的には、トラッピングカートリッジおよび分析カラムを備えたUltiMate™ 3000 RSLCnano System (ThermoFisher Scientific、米国)をペプチド分離に使用しました。 溶媒 A には LC-MS グレードの水中の 0.1% v/v ギ酸を、溶媒 B には LC-MS グレードの CAN 中の 0.1% v/v ギ酸を使用しました。 すべてのペプチドを、溶媒 A の流量 30 mL/min-1 で 3 分間トラッピング カートリッジにロードし、2 ～ 28% 溶媒 B で開始して分析時間 90 分間、0.3 mL/min-1 で溶出しました。溶出後、40% B に増加し、さらに 80% B 洗浄ステップを経て、最後に開始条件に再平衡化します。 LC システムは、Nanospray-Flex イオン源と 360 μm OD × 20 μm ID の Pico-Tip エミッターを使用して質量分析計に直接接続されました。 先端10μm。 質量分析計は、スプレー電圧 2.3 kV、キャピラリー温度 275 °C の陽イオンモードで操作されました。 質量範囲 350 ～ 1400 m/z のフルスキャン MS スペクトルは、解像度 70,000 [最大充填時間 100 ms または最大 3e6 イオン (自動ゲイン制御、AGC)] を使用してプロファイル モードで取得されました。 20 秒の動的除外ウィンドウ (正規化された衝突エネルギーは 26) を使用して、MS スキャン (データ依存の取得) で電荷 2 ～ 4 の上位 20 のピークに対して断片化がトリガーされました。 前駆体は 1.7 m/z で分離され、MS/MS スペクトルは解像度 17,500 (最大充填時間 50 ms または AGC ターゲット 1e5 イオン) のプロファイル モードで取得されました。 データ分析には、MS 生データを MaxQuant 1.6.170 で分析しました。 Chaetomium Thermophilum プロテオーム配列は、Uniprot から Proteome ID UP000008066 でダウンロードされました。 MS データは、Chaetomium Thermophilum プロテオーム配列と MaxQuant によって提供された一般的な夾雑物配列に対して検索されました。 MaxQuant のデフォルト設定は、酸化およびアセチル (タンパク質 N 末端) 修飾とともに使用されました。 タンパク質の同定には 1% の誤検出率 (FDR) カットオフが使用され、ラベルフリーのタンパク質の定量には iBAQ 強度が使用されました。 iBAQ 強度を計算する場合、ペプチド溶出プロファイルの最大検出器ピーク強度をペプチド強度として使用しました。 次に、すべての同定されたペプチド強度が加算され、同定されたペプチドの総数によって正規化されました。

架橋質量分析サンプルを調製するために、最適な架橋剤濃度を特定するための滴定が最初に実行されました（補足図7）。 上記のC. Thermophilumネイティブライセート分画からの画分3〜9（補足図7A）を総量1.4 mL、タンパク質濃度0.48 mg・mL-1になるまでプールし、その後、それぞれを等量の7部分に分割しました。エッペンドルフチューブ。 最初のチューブには架橋剤を添加せず、対照として保持し、残りには、5μLの0.16、0.32、0.63、1.25、2.5および5mMの架橋剤BS3をそれぞれ添加した。 サンプルを氷上で 2 時間インキュベートし、その後 50 mM NH4HCO3 を添加して架橋反応を失活させ、再度氷上で 30 分間インキュベートしました。 次に、サンプルをアセトン互換チューブに移し、サンプル量の 4 倍の冷 (-20 °C) アセトンを加え、チューブをボルテックスし、再度 -20 °C で 60 分間インキュベートし、4 ℃で 10 分間遠心分離しました。 15,000×g。 上清を適切に除去し、次いでアセトンを蒸発させるためにチューブを開いたまま室温に置いた。 滴定結果を視覚化するために、7 本の各チューブのペレットを 1X SDS-PAGE サンプルローディングバッファー (250 mM Tris-HCl pH 6.8、8% w/v ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 4X ストックから希釈) に再懸濁しました。 0.2% w/v ブロモフェノール ブルー、40% v/v グリセロール、20% v/v β-メルカプトエタノール) を最終タンパク質濃度 10/20 μg・mL-1 まで添加しました。 次に、サンプルを 90 °C で 5 分間煮沸し、Mini-PROTEAN® Precast Gels (BioRad、USA) にロードし、150 V で 60 分間電気泳動しました。電気泳動後、ゲルを水で 2 回洗浄し、クーマシー染色で染色しました。ゲルの背景が完全に脱色されるまで脱色します。 ゲルの目視検査後、サンプルの架橋を進めるために最適濃度の 1 mM BS3 が選択されました (補足図 7B)。 最適な架橋剤濃度が決定されたので、上記の C. Thermophilum ネイティブ ライセート分画からの画分 3 ～ 9 を再度プールしましたが、今回は 2 つのプール、3 ～ 6 と 7 ～ 9 に分けました。 各プールの Protein LoBind エッペンドルフ チューブに 100 μL の 8 M 尿素を加え、次に遠心真空エバポレーターで室温で一晩遠心分離しました。 次いで、各プールからの１００μＬを、尿素粉末を含む各チューブに移し、１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）を加えた。 次いで、ＤＴＴも最終濃度２．５ｍＭ（１００ｍＭ ＡＢＣに溶解した１００ｍＭ ＤＤＴストックから）で添加し、室温で３０分間インキュベートした。 インキュベーション終了後、2-ヨードアセトアミド (IAA) を最終濃度 5 mM で添加し、続いて暗所、室温で 30 分間インキュベートしました。 トリプシン活性部位におけるセリンの修飾を防ぐために、2.5 mM DTT を添加して反応を停止させました。 その後、LysC (1 μg μL-1 ストック、1:100 比、w/w) を添加し、サンプルを再び室温で 4.5 時間インキュベートしました。 50 mM ABC をサンプルに添加すると、尿素濃度が <2 M に低下しました。トリプシン (1 μg μL-1 ストックから、1:50 の比率、w/w) をサンプルに導入し、次に室温で一晩インキュベートしました。 、参考文献に記載されているように、STop And Go Extraction (STAGE) TIPS 脱塩手順が続きます。 71. 最終的な架橋ペプチドサンプルに同じ LC-MS/MS プロセスを適用し、結果を MS タンパク質同定法で上述したように分析しました。 MS/XL-MS データを視覚化するすべてのプロットは、xiVIEW オンライン Web サーバー 72 を使用して作成されました。

質量分析により同定されたタンパク質は、Kastritis et al. に記載されている提供された高次アセンブリにマッピングされました。 （2017）19． これらの高次アセンブリは、タンパク質データ バンクに対する Uniprot エントリごとの相同性検索を利用してさらに強化され、2017 年以降に PDB 構造で解決された可能性のある相同サブユニットも含まれました。このために、Blastp が使用されました (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) は、デフォルトでは PDB データベースに対して使用されます。 次に、Kastritis らが提供するネットワークとコミュニティについて説明します。 (2017) は、この研究で報告されたネットワークをさらに拡大するための基礎として機能しました。 これは、タンパク質をそれらのネットワークにマッピングし、それらを STRING73 データベースに含め、特定された相互作用を第 1 および第 2 シェルの相互作用因子およびコミュニティを含むネットワークに拡張することによって実行されました。 次に、C. Thermophilum に特異的なローカル STRING ネットワーク クラスターが取得され、STRING クラスターに存在するすべてのタンパク質に対する同定されたタンパク質の単純な分割によって、文字列クラスターごとの適用範囲が報告されます。 これは、MS および XL-MS データへのバック マッピングを介して、これらの拡張されたネットワークから実行されました。 最後に、データベース内の濃縮検出基準 74 を利用してネットワークの生物学的重要性がチェックされ、ここで派生した 54 個のクラスター (タンパク質コミュニティ) のすべてで生物学的相互作用が大幅に濃縮されていることが示されました。 ネットワークの視覚化は Cytoscape75 を使用して実行されました。 完全な TCA サイクルの回復は、KEGG76 を利用して推定されました。

Uniprot ID: G0S3G5 (C. Thermophilum 推定ホロシトクロム C シンターゼ - 配列長: 382)、Uniprot ID: Q7S3Z3 (N. crassa Kgd4 タンパク質として特徴付けられる - 配列長: 130)、および Uniprot ID: Q7S3Z2 (N. crassa)推定ホロシトクロム C シンターゼ - 配列長: 317) を Uniprot データベースから .fasta 形式でダウンロードし、G0S3G5 と Q7S3Z3 および G0S3G5 と Q7S3Z2 の 2 つの別個のアラインメント ペアで Clustal Omega77 とアラインメントしました。 .aln ファイルはダウンロードされ、Jalview78 で視覚化されました。 アライメント結果を補足図8に示します。Uniprotのタンパク質IDが更新され、P9WES7は推定ホロシトクロムCシンターゼ（長さ：287 aa）に対応し、P9WES8は同定されたE3BPo（長さ：135 aa）に対応しました。

OGDHc 代謝の形成に関与するすべてのタンパク質、つまり E1o、E2o、および E3 の AlphaFold2 由来モデルは、上記で実行された架橋分析から得られた分子内架橋を使用することによって、その品質が検証されました。 それぞれ E1o、E2o、および E3 のすべての同定された分子内架橋は、社内の Python スクリプトを使用して対応するモデルにマッピングされ、実現可能性について手動で評価されました。 補足図9Aには各モデルの距離分布がプロットされており、対応するデータは補足データ2に含まれています。

実行されたすべての統計分析は、「方法」の各サブセクションで適切に説明されており、分析に適用された統計手法、信頼区間、生物学的反復の数、技術的反復の数、標準偏差、および相互相関スコアが含まれます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 すべての図のソース データは、この文書の対応する補足データ項目で提供されます。 OGDHc のネイティブ 24 mer コアの Cryo-EM マップおよびモデルは、それぞれ受託番号 EMD-16900 および 8OIU で EMDB および PDB に寄託されています。 OGDHc の非対称クライオ EM マップは EMD-16900 に含まれています。 生のムービー、合計された顕微鏡写真、およびグリッド アトラスは、受託番号 EMPIAR-11502 で EMPIAR に寄託されています。 質量分析データは補足データ 2 として利用できます。

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有益な議論をしていただいたカストリティス研究室のメンバー全員に感謝いたします。 この研究は、Horizo​​n Europe ERA チェア「hot4cryo」プロジェクト番号 101086665 (PLK へ)、連邦教育研究省 (BMBF、ZIK プログラム) (助成金番号 03Z22HN23、03Z22HI2 および 03COV04) の資金提供を通じて欧州連合によって支援されました。 PLK)、ザクセン アンハルト州欧州地域開発基金 (EFRE) (PLK への補助金番号 ZS/2016/04/78115)、ドイツ建設機構 (プロジェクト番号 391498659、RTG 2467)、マルティン ルター大学ハレ-ヴィッテンベルク。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

これらの著者は同様に貢献しました: Ioannis Skalidis、Fotis L. Kyrilis、Christian Tüting。

学際的研究センター HALOmem、チャールズ タンフォード プロテイン センター、マルティン ルーサー大学 ハレ ヴィッテンベルク、Kurt-Mothes-Strasse 3a、06120、ハレ/ザーレ、ドイツ

ヨアニス・スカリディス、フォティス・L・キリリス、クリスチャン・テューティング、ファルザド・ハムディ、トニ・K・トレーガー、ジェイディープ・ベラピュール、パナギオティス・L・カストリティス

マルティン・ルーサー大学ハレ・ヴィッテンベルク生化学・バイオテクノロジー研究所、Kurt-Mothes-Straße 3、06120、ハレ/ザーレ、ドイツ

ヨアニス・スカリディス、フォティス・L・キリリス、トニ・K・トレーガー、パナギオティス・L・カストリティス

Biozentrum、マルティン ルーサー大学ハレ ヴィッテンベルク、Weinbergweg 22、06120、ハレ / ザーレ、ドイツ

ゲルト ハウス & パナギオティス L. カストリティス

マルティン・ルーサー大学ハレ・ヴィッテンベルク、クルト・モセス通り、生化学・バイオテクノロジー研究所、植物生化学部門 3a、06120、ハレ / ザーレ、ドイツ

マルタ・フラティーニ & インゴ・ハイルマン

構造生物学センター、がん研究センター、国立がん研究所 (NCI)、フレデリック、メリーランド州、21702-1201、米国

フランシス・J・オライリー

バイオアナリティクス、バイオテクノロジー研究所、ベルリン工科大学、13355、ベルリン、ドイツ

ラップシルバーを示しています

エディンバラ大学生物科学部ウェルカム細胞生物学センター、エディンバラ、EH9 3BF、スコットランド、英国

ラップシルバーを示しています

ケミカルバイオロジー研究所、国立ギリシャ研究財団、アテネ、11635、ギリシャ

パナギオティス L. カストリティス

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FLK は、質量分析では FJO、反応速度論的アッセイでは TKT の支援を受けて、実験作業を実施しました。 GH と MF は細胞イメージングを実行しました。 FH が顕微鏡写真を取得しました。 IS はクライオ EM 再構成を計算し、計算モデリングを実行しました。 CT は計算モデリングを実行しました。 JB はリンカー距離の統計分析を実行しました。 PLK、IH、JRは資金を確保した。 PLKがこのプロジェクトを発案しました。 IS と PLK は、すべての著者からの寄稿を受けて原稿を執筆しました。

Panagiotis L. Kastritis への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

この原稿は、別の Nature Portfolio ジャーナルで以前にレビューされています。 この原稿は、Communications Biology でのさらなる審査なしで出版に適していると考えられました。 主な取り扱い編集者: Gene Chong。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Skalidis, I.、Kyrilis, FL、Tüting, C. 他内在性 4 メガダルトンのスクシニル CoA 生成代謝物の構造解析。 Commun Biol 6、552 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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受信日: 2023 年 3 月 13 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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