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Aug 06, 2023

H2O2 は二核鉄を選択的に損傷します

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7652 (2023) この記事を引用

295 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

NADH:ユビキノン酸化還元酵素、呼吸複合体 I は、電子伝達とプロトン移動を結びつけることにより、細胞のエネルギー代謝において主要な役割を果たします。 電子移動は、フラビン モノヌクレオチドと一連の鉄硫黄 (Fe/S) クラスターによって触媒されます。 反応の副産物として、還元されたフラビンは活性酸素種 (ROS) を生成します。 一般に、呼吸鎖によって生成される ROS が複合体の Fe/S クラスターに損傷を与える可能性があることが示唆されました。 ここでは、二核 Fe/S クラスター N1b が H2O2 によって特異的に損傷を受けるが、それは高濃度でのみであることを示します。 しかし、同じ条件下では、N1b は電子移動中に簡単にバイパスできるため、複合体の活性はほとんど影響を受けません。

エネルギー変換する NADH:ユビキノン酸化還元酵素、呼吸複合体 I は、NADH の酸化とユビキノン (Q) の還元を膜を通過するプロトンの移動と結びつけることで、細胞の生体エネルギー学において重要な役割を果たしています 1,2,3,4,5,6。 これは、電子移動を触媒する周辺アームと、プロトンの移動を担う膜アームで構成されます。 2 本のアームは互いにほぼ垂直に配置され、複合体の L 字型構造が得られます。 ミトコンドリア複合体 I は、エネルギー変換する NADH:Q オキシドレダクターゼを含むすべての種に見られる 14 個のコア サブユニットを含む 45 個のサブユニットで構成されています7,8。 複合体 I のコアサブユニットの三次元構造は、細菌から哺乳類まで保存されています 9,10。 大腸菌の細菌複合体は、NuoA から NuoN と名付けられた 13 の異なるサブユニットで構成されており、そのうちの 2 つは単一のサブユニット NuoCD11 に融合されています。 それらは nuo-genes によってコードされており、合計すると約 530 kDa の分子量になります 12。

NADH は、一次電子受容体フラビン モノヌクレオチド (FMN) への水素化物転移によって末梢アームの先端で酸化されます 13。 ここから、電子は一連の 7 つの鉄硫黄 (Fe/S) クラスターを介して膜に向かって約 100 Å の距離を移動します。そこで Q は、膜のサブユニットで構成される特異的な結合キャビティ内で還元され、プロトン化されます。末梢および膜アーム1、2、3、4、5、6。 AQ 種は、空洞内の高エネルギー結合部位から低エネルギー結合部位に移動し、膜アーム内のプロトンの移動を駆動する静電的および構造的変化を引き起こすと考えられています 2,14,15,16。 膜アームには、荷電残基の中心軸によって相互に接続され、Q キャビティに接続されていると推定される 4 つのプロトン経路が含まれています。 その空洞内での Q 種の動きは、膜アームを通って前後に移動する「電波」の伝播を誘発し、プロトンの移動を引き起こすと提案されています 16。 あるいは、キノンの結合が「開いた」状態から「閉じた」状態への遷移を引き起こすことが示唆されています10。 キノンの還元により、膜アーム内のプロトンが再分布され、NuoL10 のみでプロトンが細胞質に放出されます。

複合体 I による NADH の酸化は、スーパーオキシドや過酸化水素などの活性酸素種 (ROS) の生成に関連しており 17、18、19、20 、細胞ストレスに寄与します 21。 複合体 I によって生成される ROS は、還元された FMN17、18、19、20 に由来することが一般に受け入れられています。 酸化された NADH の約 0.1 ～ 2% が、in vitro で ROS 産生を引き起こします 22,23,24,25。 ROS は、脂質過酸化、タンパク質分解、DNA 酸化などの酸化損傷に寄与するだけでなく、必須の酸化還元シグナルとしても機能します 26、27、28、29。

ROS 生成 FMN 補因子は、呼吸複合体 I の Fe/S クラスターのすぐ近くに位置しています。溶媒にさらされた Fe/S クラスターは酸化損傷を受けやすいことがよく知られています 30,31。 さまざまな生物由来の錯体 I の構造は、その Fe/S クラスターの大部分が溶媒から保護されているため、ROS7、8、9、10、32、33、34、35、36 による分解から保護されるはずであることを示しています。 それにもかかわらず、錯体 I および一般に呼吸鎖による ROS 産生の増強により、錯体 I37 の Fe/S クラスターに損傷が生じる可能性があることが提案されました。 ここでは、大腸菌複合体 I を使用してこの提案をテストしました。 ミトコンドリア複合体 I の構造最小形態を表すことにより、大腸菌由来のものには、触媒コアを囲む追加のアクセサリー サブユニットが欠けています。 したがって、大腸菌複合体 I の Fe/S クラスターは、ミトコンドリア複合体 I の同族体よりも酸化損傷を受けやすい可能性があります。大腸菌複合体 I は主に H2O2 の形で ROS を生成することが知られているため 38,39、らは、錯体 I 活性およびその Fe/S クラスター組成に対する H2O2 の影響を分析しました。 NADHオキシダーゼ活性を阻害するにはミリモル濃度のH2O2が必要であることが判明した。 単離された複合体の NADH:デシル-ユビキノン活性は 1 mM H2O2 の存在下で変化しませんが、1 mM H2O2 での処理によりサブユニット NuoG 上の Fe/S クラスター N1b が選択的に消失することを EPR 分光法を使用して直接実証しました。

細胞のカタラーゼとペルオキシダーゼの活性により、大腸菌細胞質内の H2O2 濃度は低ナノモル範囲にあります 40,41。 ただし、外因性 H2O2 を添加すると、一時的な細胞内濃度がマイクロモル範囲に増加する可能性があります 42。 したがって、複合体 I 媒介 NADH 酸化に対するマイクロモル H2O2 濃度の影響は、最初に膜内のタンパク質を用いて測定されました。 BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis株の細胞膜を分画遠心分離により得た。 代替 NADH デヒドロゲナーゼ (ndh) の欠如と染色体 nuo オペロンの破壊により、この株の膜の NADH 由来の活性はすべて、プラスミド上にコードされている野生型複合体 I の活性のみを反映します。

複合体 I の NADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性は、NuoF に結合した FMN によって触媒され、Fe/S クラスターの関与は関与しません。 さらに、この活動はプロトンの移動とは連動していません。 マイクロモル濃度の H2O2 はこの活性に影響を及ぼさないことが判明しました。 ミリモル濃度のみが NADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性に有意な影響を及ぼしました (図 1A)。 最大 20 mM H2O2 による滴定では、見かけの IC50 が 14.4 mM で活性が 55% 阻害されました。

H2O2による複合体Iの阻害。 (A) BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis株由来の膜のNADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性。 100% 活性は 1.4 U mg-1 に相当します。 (B) BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis 株の膜の NADH オキシダーゼ活性。 100% 活性は 0.27 U mg-1 に相当します。 (C) 単離された複合体 I の NADH:デシルユビキノン酸化還元酵素活性。100% 活性は 21.9 U mg-1 に相当します。 データ ポイントを通る赤い線は、ガイドとしてのみ含まれています。 各データ ポイントは、2 つの生物学的サンプルからの 3 つの技術的複製の平均です。 バーは各データ点の SEM を表します。

Fe/S クラスターを介した Q への電子伝達を含む複合体 I の生理活性に対する H2O2 の影響をアッセイするために、NADH オキシダーゼ活性に対する H2O2 の影響を測定しました (図 1B)。 NADH/フェリシアン化物オキシドレダクターゼ活性についてすでに観察されているように、H2O2 は NADH オキシダーゼ活性をミリモル範囲でのみ阻害します。 最大 20 mM H2O2 で滴定すると、活性が約 55% 阻害され、見かけの IC50 は 13.5 mM でした。 両方の阻害曲線の類似性は、膜内の複合体 I に対する H2O2 の非特異的効果を示唆しています。

阻害が可逆的であるかどうかを確認するために、膜の未処理アリコートと 20 mM H2O2 で処理したアリコートを 3 回遠心分離し、それぞれを H2O2 を含まないバッファー A に再懸濁しました。 処理サンプルの NADH/フェリシアン化物および NADH オキシダーゼ活性は、どちらの場合も未処理サンプルの 50 ± 5% でした。 これは、H2O2 による阻害が不可逆的であることを示唆しています。

複合体Iに対するH2O2の影響を具体的に調べるために、界面活性剤LMNGの存在下でタンパク質を単離し（補足図S1を参照）、H2O2による調製物のNADH：デシル-Qオキシドレダクターゼ活性の阻害を測定しました。 1.25 mM H2O2 までの範囲では、複合体 I 活性に対する影響は検出できませんでした (図 1C)。 20 mM H2O2 を添加すると、活性が 65% 阻害されました。 要約すると、私たちの実験は、生理学的条件下で観察される濃度では、H2O2 が複合体 I の活性に影響を及ぼさないことを示しています。

それでもH2O2が複合体のFe/Sクラスターに損傷を与える可能性があるかどうかを判断するために、調製物をアリコートに分割し、サンプルを緩衝液または様々な濃度の等量のH2O2で処理しました。 サンプルを 2000 倍モル過剰の NADH で還元し、H2O2 とともに周囲温度で 1 分間インキュベートし、その後 150 K の冷媒溶液中で凍結させました。EPR スペクトルを 40 K および 2 mW のマイクロ波出力で記録し、2 つの二核核を検出しました。錯体 I、N1a、N1b の Fe/S クラスター。 さらに、四核クラスター N2、N3、および N4 を検出するために、スペクトルを 13 K および 5 mW で記録しました。 複合体の他の Fe/S クラスターは EPR43 では検出できません。 緩衝液のみが付属したサンプルを参照として使用しました。 最初に H2O2 で処理し、次に NADH で還元したサンプルでは、​​同様の EPR スペクトルが得られました。 NADHによる還元の前後にサンプルをH2O2と30分間インキュベートしてもスペクトル変化は生じませんでした。

40 K、2 mW のマイクロ波出力で得られた参照サンプルのスペクトルは、二核クラスター N1a (gx、y、z = 1.92、1.94、および 2.00) および N1b (g//、⊥ = 2.03 および 1.94;図2a)。 四核 Fe/S クラスター N2 (g//,⊥ = 1.91 および 2.05)、N3 (gx,y,z = 1.88、1.92、および 2.04)、および N4 (gx,y,z = 1.89、1.93) のシグナル、および2.09）は、二核クラスターのシグナルに加えて、13 Kおよび5 mWのマイクロ波出力で記録されたスペクトルに存在していました（図2d）。

さまざまな H2O2 濃度での単離された大腸菌複合体 I の EPR スペクトル。 スペクトルは、未処理サンプル (a、d)、100 μM (b、e) および 1 mM (c、f) H2O2 とインキュベートしたアリコートから記録されました。 スペクトルは、二核 Fe/S クラスターを検出するために 40 K および 2 mW のマイクロ波出力 (左の列、a ～ c​​) で記録され、さらに四核 Fe/S クラスターを検出するために 13 K および 5 mW の出力 (右の列、d ～ f) で記録されました。 Sクラスター。 個々の信号は、59 に従って別個の Fe/S クラスターに割り当てられます。 g = 1.94 付近の中央の g 領域は、1.94 での N1b の g⊥ の欠如により (f) で乱されています。

最大100μMのH2O2とともにインキュベートしたサンプルのEPRスペクトルは、有意なスペクトル変化を示さなかった（図2b、e）。 ただし、1 mM H2O2で処理したサンプルは、クラスターN1bの急激かつ特異的な損失を明らかに示しました（図2c、f）。 40 Kで得られた未処理サンプルのスペクトルから1 mM H2O2で処理したサンプルのスペクトルの差は、クラスターN1bのシグナルを明確に示しています（補足図S2を参照）。 したがって、N1a の信号は差分スペクトルでも検出できるため、N1a の割合は変化していません。 ただし、N1b の完全な酸化はスペクトルの差から推定できません。 クラスターN1bの損失は、13 Kおよび5 mWのマイクロ波出力で記録されたスペクトルにも見られます（図2c、f）。 ここで、13 Kで記録されたスペクトルでは残留量N1bがまだ検出可能であり（図2f）、クラスターが完全に損傷していないことを示唆しています。 他のシグナルと重複しない g = 2.03 での N1b シグナルの二重積分は、N1b の 68% が 1 mM H2O2 によって損傷していることを示しました。 しかしながら、二核クラスターＮ１ａおよび四核クラスターＮ２、Ｎ３およびＮ４の量は、５０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下でも変化しなかった。 したがって、1 mM H2O2 は二核クラスター N1b に特異的な損傷をもたらしますが、アッセイでは H2O2 濃度が最も高くても、複合体 I の他の Fe/S クラスターには影響を与えません。

クラスター N1b が H2O2 によって単に酸化されているのか、それとも「過剰酸化」されているのかを区別するために、複合体 I を 1 mM H2O2 とともに 5 分間インキュベートしました。 続いて、濃縮と希釈を繰り返すことで過剰な H2O2 を除去しました。 サンプルは NADH で還元され、EPR スペクトルはクラスター N1b の欠如を示しています (補足図 S3 を参照)。 したがって、N1b は単純に酸化されるのではなく、H2O2 によって不可逆的に損傷を受けます。

さまざまな種からの錯体の構造は、Fe/S 中心が溶媒にさらされていないことを示しています。 それにもかかわらず、なぜ N1b が H2O2 によって攻撃されるのかを調べるために、すべての Fe/S クラスターを含む大腸菌複合体の末梢アームのクライオ EM 構造を詳しく調べました 44。 N1bは、NuoGのN末端部分にある典型的な[2Fe-2S]フェレドキシンフォールドの4つのシステイン残基によって配位されています（図3）。 このドメインは、NuoE と NuoF を NuoG で接続します。 クラスター N1b は、NuoG の表面から約 5 Å の距離に局在していますが、溶媒は直接アクセスされていません (図 3)。 プログラム CAVER を使用して、タンパク質表面からクラスターにつながる可能性のある溶媒チャネルを特定しました。 直径 2.28 Å のチャネルが溶媒からクラスターまでつながっています (図 3A)。 このチャネルには、残基 Gly45G、Arg46G、および Met67G が隣接しています (上付き文字は大腸菌複合体 I のサブユニットの名前を指します)。 ミトコンドリア複合体 I にはいくつかのアクセサリー サブユニットが含まれており、その数は特定の生物によって異なります。 しかし、これらのアクセサリーサブユニットはどれも、クラスター N1b を溶媒に対してさらに遮蔽しません。 例として、ヒツジミトコンドリア36由来の複合体IのクラスターN1bの環境を図3Bに示す。 ミトコンドリア複合体 I では、N1b はタンパク質表面の下約 8.2 Å に位置しています。 ここで、チャネルの直径は 2.26 Å とわずかに小さく、U 字型に長い距離にわたって伸びています (図 3B)。 これは、大腸菌 NuoF のホモログであるサブユニット NDUFV1 の Leu225 と大腸菌 NuoG のホモログである NDUFS1 の Arg53 の存在によるもので、どちらもクラスターへの直接経路をブロックします。 ヒツジ複合体 I では、この経路は、NDUFS1 の残基 Gly50、Arg53、Ala67、および Ala70、および NuoG44 のエクストラドメインの構造相同体であるアクセサリーサブユニットであるサブユニット NDUFS4 の Tyr118 によってさらに制御されます。 どちらの生物でも溶媒チャネルは十分に大きく、クラスターへの H2O2 の通過を可能にします。 内層原子の一部は疎水性であり、迅速な通過を妨げますが、遮断することはありません。 したがって、H2O2 の添加はおそらくミトコンドリア複合体 I の N1b の損傷にもつながると考えられます。

大腸菌および大腸菌におけるクラスター N1a および N1b の H2O2 に対する表面アクセス性。 表面チャネルは、PDB ID 7AWT (大腸菌) および 7ZD6 (大腸菌) の CAVER 3.0.3 でプローブされました。 くびれのチャネル中心までのライニング原子の距離が示されており、さらにダッシュで示されています。 (A、B) 大腸菌 (A) および大腸菌 (B) の N1b につながる溶媒チャネル。 提供された直径は狭いですが、大腸菌では 2.28 Å、大腸菌では 2.26 Åで H2O2 が N1b に通過できるのに十分であると考えられます。 O. aries complex I では、クラスターへの直接の道が NDUFS1 の R53 によってブロックされていることに注意してください。 N1b から溶媒が接触しやすい表面までの直線距離は、それぞれ 4.9 Å (大腸菌) と 8.2 Å (大腸菌) になります (表示なし)。 (C、D) N1a の H2O2 アクセス可能性は、チャネル直径 1.98 Å (大腸菌) および 1.90 Å (O. aries) に制限されます。 くびれにある無極性原子は、極性分子を効果的に反発します。 N1a 鉄原子から表面までの最小距離は、それぞれ 7.3 Å (E. coli) と 9.3 Å (O. aries) です (表示なし)。

H2O2 は大腸菌複合体 I 活性に影響を及ぼさないことが以前に報告されています 42。 しかし、データは示されておらず、5 mM H2O2 がその活性を低下させないことが述べられているだけでした。 このデータから、H2O2 は錯体 I42 の Fe/S クラスターを酸化しないと結論付けられました。 ここで、我々は、大腸菌膜を 5 mM H2O2 とインキュベートすると、複合体 I が過剰生成されると、NADH オキシダーゼ活性が小さいながらも顕著に阻害されることを示します。 最大の半分の阻害は 13.5 mM H2O2 で達成されます (図 1B)。 NADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性の阻害は、14.4 mM H2O2 の IC50 で同様の活性経過を示しました (図 1A)。 ただし、遊離FMNおよびNADHを20 mM H2O2とインキュベートしても、それらの化学修飾は起こりません（補足図S4を参照）。 このことから、高 H2O2 濃度での NADH オキシダーゼおよび NADH/フェリシアン化物オキシドレダクターゼ活性の低下 (図 1A、B) は、非特異的なタンパク質酸化による可能性が最も高いと考えられます 45。

しかし、H2O2 は錯体の Fe/S クラスターに影響を及ぼさないという仮定とは対照的に 42、我々は、1 mM H2O2 の添加がサブユニット NuoG 上の二核クラスター N1b の酸化分解を引き起こすことを EPR 分光法によって実験的に示しました。 ２）。 分子内電子移動速度の計算により、クラスター N1b を介したクラスター N3 から N4 への電子移動は、両方とも NuoG 上に位置するクラスター N3 から N4 への直接電子移動によって簡単にバイパスできることが明らかになりました (図 4)。 この場合、還元されたフラビンは、未処理の複合体と同様に、その電子をクラスター N3 に順次移動します。 ここで、電子はクラスター N4 と N547 に現れる前に、連続した一時停止を経験します。 N3 と N4 の間の端から端までの距離は 14.9 Å であり、理論的には分子内電子移動速度が全体で 10 分の 1 に減少することになります 46,47。 Qの還元と放出はFe/Sクラスターに沿った分子内電子移動よりもはるかに遅いため、これによってNADHからQへの全体的な電子移動速度は変化しません43。 最近、我々は、大腸菌鉄硫黄クラスターキャリアタンパク質 BolA48 を欠失させることにより、クラスター N1b を欠く複合体 I 変異体を生成しました。 クラスター N1b の欠如により、活性複合体の構築が引き起こされました。 重要なのは、N1b の欠失は変異膜の NADH オキシダーゼ活性に影響を及ぼさなかったことです。これは、N1b の欠如によって NADH から Q48 への全体的な電子伝達速度が変化しなかったことを意味します。

大腸菌複合体 I の電子入力モジュールにおける Fe/S クラスターの配置を示すスキーム。クラスター N1a (NuoE)、N3 (NuoF)、N1b、N4、N5 (すべて NuoG) の相対位置が示されています。 矢印は、考えられる電子伝達経路を示しました。 クラスター間のエッジ間距離がÅ単位でそれぞれの矢印に示されています。 N1b の欠如は、N3 から N4 への直接電子移動によって回避できます (赤色、命名法は 59 に準拠)。

複合体 I の Fe/S クラスターはタンパク質内に十分に埋め込まれているため、H2O2 による N1b の酸化損傷は予想外でした。 しかし、プログラム CAVER で同定された短いチャネルは、H2O2 がタンパク質表面から細菌およびミトコンドリア複合体 I のクラスター N1b に到達する道を開きます (図 3)。 複合体の全体構造を見ると、NuoE 上のクラスター N1a が水性媒体に最も露出しているようです (図 3)。 一方、N1a のタンパク質環境は他のクラスターよりも疎水性が高くなります。 実際、CAVERは、タンパク質表面からN1aに直接つながる、大腸菌では直径1.98Å、ヒツジ複合体Iでは直径1.9Åのチャネルをそれぞれ同定した（図3C、D）。 しかし、注目すべきことに、このチャネルのそれぞれのくびれには無極性原子が並んでいます。 おそらく、チャネルのこの疎水性表面が、H2O2 がクラスター N1a に損傷を与えるのを防ぎます。

総合すると、我々のデータは、生理学的 H2O2 濃度が呼吸複合体 I の Fe/S クラスターに損傷を与えないことを明確に示しています。さらに、濃度の上昇はクラスター N1b に特異的に損傷を与えます。 しかし、N1b 損傷は複合体 I の活性に影響を与えません。これは、このクラスターが分子内電子伝達中に回避できるため、複合体の生理活性が維持されるためです。

染色体上遺伝子ndhを欠く大腸菌株BW2511349の派生株を、複合体I48を過剰生産するための宿主として使用した。 この株の染色体ヌオオペロンは、耐性カートリッジ (nptII) に置き換えられました。 宿主株を、nuo-オペロン50全体をコードするプラスミドpBADnuoHisで形質転換した。 nuo-オペロンの発現は、0.2% (w/v) L-アラビノースの添加によって誘導されました。 タンパク質の調製では、細胞を 34 μg/mL のクロラムフェニコールを含む豊富な自己誘導培地中で 180 rpm で撹拌しながら 37 °C で増殖させました51。 実験設定によれば、形質転換株の膜の NADH 誘導活性はすべて、プラスミドによってコードされ過剰生産された複合体 I の触媒活性に由来します。

細胞を遠心分離によって回収し、0.1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF) および数粒の DNAseI を含む 50 mM MES/NaOH、50 mM NaCl、pH 6.0 (緩衝液 A) に懸濁し、HPL-6 (Maximator、 1000〜1500バール）51. 細胞質膜は分画遠心分離によって得られ 51、5 mM MgCl2 および 0.1 mM PMSF を含む等量 (1:1、w/v) の緩衝液 A に懸濁しました。

複合体は記載どおりに調製されました52。 つまり、膜タンパク質を 2% (w/v) ラウリルマルトース ネオペンチル グリコール (LMNG、最終濃度) で抽出し、清澄な抽出物を 20 mM イミダゾールに調整し、平衡化した 35 mL ProBond Ni2+-IDA カラム (Invitrogen) にアプライしました。 5 mM MgCl2、10% (v/v) グリセロール、0.005% (w/v) LMNG および 20 mM イミダゾールを含むバッファー A、pH 6.8。 結合したタンパク質を、308 mM イミダゾールを含む同じバッファーで溶出しました。 NADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性を含む画分をプールし、100 kDa MWCO Amicon Ultra-15 遠心分離フィルター装置 (Millipore) で限外濾過によって濃縮し、緩衝液 A で平衡化した Superose 6 サイズ排除クロマトグラフィー カラム (300 mL、GE Healthcare) を使用して精製しました。 mM MgCl2、10% (v/v) グリセロールおよび 0.005% (w/v) LMNG。 NADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性が最も高い画分をさらなる研究に使用しました。

活性アッセイは 30 °C で実施されました。 細胞質膜の NADH オキシダーゼ活性は、記載されているように Clarke 型酸素電極 (DW1; Hansatech) を使用して測定されました 51。 電極は、空気飽和緩衝液に数粒の亜ジチオン酸ナトリウムを加えることによって校正されました51。 NADH/フェリシアン化物酸化還元酵素活性は、ダイオードアレイ分光計 (QS キュベット、d = 1 cm、Hellma; TIDAS II、J&M Aalen) を使用して 1 mM−1 cm−のεを使用して、410 nm でのフェリシアン化物吸光度の減少として測定されました。 153. アッセイは、1 mM フェリシアン化物および 0.2 mM NADH を含む緩衝液 A 中で実施されました。 反応はタンパク質の添加によって開始され、酵素反応の速度は非酵素反応の値によって補正されました。 NADH:デシル-Q オキシドレダクターゼ活性は、ε 6.3 mM-1 cm-1 (QS キュベット、d = 1 cm、Hellma、TIDAS II、J&M Aalen) を使用して 340 nm での NADH 濃度の減少として測定されました。 精製した複合体 I を大腸菌極性脂質 (10 mg mL-1; Avanti) と 1:1 (w/w) の比で混合し、氷上で 30 分間インキュベートしました。 アッセイには、5 mM MgCl2、10% (v/v) グリセロールおよび 0.005% (w/ v) LMNG。 反応は、150 μM NADH46 の添加によって開始されました。 反応の開始直前に、異なる濃度の H2O2 (30%、v/v; Chemsolute) をアッセイに添加しました。

H2O2 阻害の可逆性を調べるために、膜を 20 mM H2O2 とともに 5 分間インキュベートしました。 処理済み膜と未処理膜のアリコートを遠心分離し (178,000g、4 °C、60 分、ローター 60Ti、Sorvall wX + 超遠心機、Thermo Scientific)、5 mM MgCl2 および 0.1 mM を含む 10 倍容量のバッファー A に再懸濁しました。 PMSF。 この手順を 2 回繰り返し、両方のサンプルの NADH/フェリシアン化物および NADH オキシダーゼ活性を測定しました。

EPR 測定は、X バンドで動作する EMX 6/1 分光計 (Bruker) を使用して実施されました。 サンプル温度は、ESR-9 ヘリウムフロークライオスタット (Oxford Instruments) で制御しました。 スペクトルは、40 K および 2 mW のマイクロ波出力、および 13 K および 5 mW のマイクロ波出力で 300 ～ 380 mT で記録されました。 他の EPR 条件は次のとおりです。マイクロ波周波数、9.360 GHz。 変調振幅、0.6 mT。 時定数、0.164秒。 スキャン速度、17.9 mT min−1。 バッファー A 中の 300 μL 複合体 I (2.5 ～ 3.5 mg mL-1) を 2000 倍モル過剰の NADH (10 ～ 14 mM) で還元し、2-メチルブタン/メチルシクロヘキサン (1:5; v: v)。

H2O2 がクラスター N1b を酸化または損傷するかどうかを確認するために、複合体 I を 1 mM H2O2 と 5 分間インキュベートしました。 限外濾過 (Amicon Ultra-15、MWCO: 100 kDa、Millipore、3800 g、4 °C、ローター A-4-44、遠心分離機 5804R、Eppendorf) によってサンプルを濃縮し、その後バッファー A で 10 倍希釈することによって、過剰な H2O2 を除去しました。 5 mM MgCl2、10% (v/v) グリセロール、および 0.005% (w/v) LMNG を使用。 この手順を２回繰り返した。 2000 倍モル過剰の NADH で還元された濃縮サンプルの EPR スペクトルが記録されました。

大腸菌およびヒツジ複合体 I の Fe/S クラスターの溶媒アクセス可能性は、PyMOL プラグイン CAVER (バージョン 3.0.3)54,55 を使用して、最小半径 0.90 ～ 1.20 Å で、末梢アームの pdb モデル 7AWT を使用してプローブされました。すべてのクラスター44とヒツジ複合体I36のpdbモデル7ZD6。

タンパク質濃度は、BSA を標準として使用するビウレット法に従って測定されました 56。 精製複合体 I の濃度は、アミノ酸配列 57 に由来する 781 mM-1 cm-1 のεを使用して、UV/可視分光法 (TIDAS II、J&M Aalen) によって決定されました。 SDS-PAGE (ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動) は、10% 分離ゲルと 3.9% スタッキングゲルを使用して実行されました58。 H2O2 による FMN と NADH の酸化の可能性を LC-MS 分析によって分析しました。 バッファー A 中の 1 mM FMN および 1 mM NADH (両方とも Sigma Aldrich 製) を 20 mM H2O2 とともに周囲温度で 30 分間インキュベートし、その後 HPLC (ProntoSIL 120-3-C18; AQ plus; 1 mL、150 × 3.0) に供しました。 mm) 10% 酢酸トリエチルアンモニウム (100 mM) および 90% 水中で 0.5 mL min-1 の流速で。 1 分後、10 ～ 90% アセトニトリルの勾配を 17 分間かけて適用しました。 溶出サンプルは API-MS (Dionex MSQ Plus) によって直接分析されました。

この記事の調査結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、補助金 278002225/RTG 2202 および SPP1927 により、ドイツ財団ゲマインシャフト (DFG) によって支援されました。 FR 1140/11-2 から TF まで。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

アルバート・ルートヴィッヒ大学フライブルク生化学研究所、アルバート通り 21、79104、フライブルク、ドイツ

リサ・ストロートマン、キャロライン・ハーター、タチアナ・ゲラシモワ、ダニエル・ウォルヴェント、トルステン・フリードリッヒ

アルバート・ルートヴィッヒ大学フライブルク有機化学研究所、アルバート通り 21、79104、フライブルク、ドイツ

ケビン・リッター & ヘニング・J・ジェッセン

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LS、CH、TG はタンパク質を精製し、LS は活性測定を実行してデータを取得し、TF は EPR スペクトルを記録し、DW は計算を実行し、KR と HJJ は LC-MS データを記録し、著者全員がデータを分析しました。 TF は著者全員の協力を得て原稿を書き、TF が研究をデザインしました。

トルステン・フリードリヒへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Strotmann、L.、Harter、C.、Gerasimova、T. 他。 H2O2 は、呼吸複合体 I の二核鉄硫黄クラスター N1b を選択的に損傷します。Sci Rep 13、7652 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5

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受信日: 2023 年 2 月 8 日

受理日: 2023 年 5 月 8 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5

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