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May 07, 2023

前臨床の特性評価と抗

Trasduzione del segnale e terapia mirata

Signal Transduction and Targeted Therapy volume 8、記事番号: 27 (2023) この記事を引用

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編集者様へ、

2019年世界的パンデミックコロナウイルス感染症（COVID-19）の原因物質である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、それ自体が予測不可能な進化能力を持つ非常に毒性の高い呼吸器病原体であることが証明されており、持続的な脅威をもたらしている人類に。 この原稿の出版時点では、優勢な Omicron 変異体は、著しく高い感染力を特徴としており、新たに出現した亜変異体は、ワクチン接種と以前の感染の両方によって誘発される中和から実質的に逃れることを示し、ワクチンの突破または再感染のリスクを高めています。ウイルス感染と重篤な疾患または死亡への疾患進行のリスクを軽減するための対策として、作用する抗ウイルス薬が切実に必要とされています。

レムデシビル (RDV) は、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の治療薬として承認された最初のヌクレオチド類似体です。 入院していない高リスク患者に RDV を早期に投与すると、入院または死亡のリスクを 87% 削減できる可能性があります 2。ただし、RDV は静脈内投与が義務付けられているため、新型コロナウイルス感染症の外来患者は容易に利用できません。 以前、我々は、親の 1'-CN-4-アザ-7,9-ジデアザアデノシン C-ヌクレオシド (GS-441524) が、in vitro で SARS-CoV-2 に対して RDV よりも強力であることを発見しました。3 GS-441524 の創薬可能性と経口バイオアベイラビリティ、4、本明細書では、潜在的な経口ヌクレオシド薬候補である ATV014 の前臨床特性評価と抗 SARS-CoV-2 効果を報告します。

最初に、GS-441524の5'-OH基にエステルを選択的に導入して4a〜4mを得ることで、プロドラッグ戦略に基づいて一連のアデノシン誘導体を設計および合成しました（補足図S1）。 これらの新たに合成された化合物の中で、シクロヘキシルカルボキシレート類似体 4a (ATV014) (図 1a、EC50 = 0.48 μM) は、SARS-CoV-2 レプリコンに対する強力な薬剤として同定され、GS よりも約 3.4 倍強力でした。 -441524 (EC50 = 1.644 μM) (補足表 S1)。 SDラットのPKプロファイルを比較するために、ATV014、テトラヒドロ-2H-ピラン-4-カルボキシラートアナログ（4時間）およびパルミチン酸アナログ（4μl）を選択しました（補足表S2）。 25 mg/kg の単回経口投与により、ATV014 は経口バイオアベイラビリティ (F%) が 53.4%、T1/2 が 1.9 時間向上し、4 時間および 4 リットルの場合より優れていることが実証されました。 良好な経口PKと効力を考慮して、ATV014は、生きたウイルスを用いたさらなる抗SARS-CoV-2実験のために選択されました。 図1bに示すように、Vero E6細胞では、B.1（IC50 = 0.46μM）、ベータ（IC50 = 0.13μM）、デルタ（IC50 = 0.24μM）およびオミクロン（IC50 = 0.013μM）に対するATV014の抗ウイルス活性) RDV および GS-441524 と比較して大幅に改善されました。 Vero E6 細胞における ATV014 の平均細胞傷害濃度 (CC50) 値は 263.8 μM でした。 特に、Omicron 変異体に対する ATV014 の治療指数 (CC50/EC50) は 20292 に達しました。 さらに、A549-ACE2 細胞の B.1 株に対して、ATV014 は 0.0562 ± 0.016 μM の EC50 値を示しました (補足図 S2)。 これらの結果は、特に最近流行している Omicron に対して高い効力と、ATV014 の毒性が比較的低いことを示しました。

潜在的な経口抗 SARS-CoV-2 薬 ATV014 の定義とその前臨床特性評価。 a レムデシビル、GS-441524、および ATV014 の化学構造。 b SARS-CoV-2のB.1、ベータ、デルタ、およびオミクロン株に対するRDV、GS-441524、およびATV014の抗ウイルス活性と、Vero E6細胞における対応する細胞毒性。 c K18-hACE2マウスモデルにおける予防効果の概略図。 K18-hACE2 マウスに SARS-CoV-2 デルタ変異体 (マウスあたり 5 × 102 PFU ウイルス) を鼻腔内接種し、直ちにビヒクル、ATV014 (100、300 mg/kg) または EIDD-2801 (300 mg/kg) で経口治療しました。 ）、接種前に3日間継続した（ビスインダイ（BID）、グループあたりn = 4）。 以下の結果は、qRT-PCR (定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応) によるマウス肺における SARS-CoV-2 N 遺伝子コピーの豊富さと、3 dpi での FFA (焦点形成アッセイ) によるウイルスの生存率を示しました。 qRT-PCR の検出限界は 0.5 コピー/μL でした。 赤い破線は、FFA の検出限界を示します。 d 治療効果のフローシート。 K18-hACE2 マウスに SARS-CoV-2 デルタ変異体 (マウスあたり 5 × 102 PFU) を鼻腔内接種し、ビヒクル、ATV014 (10、20、50、100、または 200 mg/kg)、または EIDD-2801 で治療しました。 SARS-CoV-2感染から2時間後に(200mg/kg)(各グループn=10)。 以下の結果は、qRT-PCR によるマウス肺における SARS-CoV-2 N 遺伝子コピーの豊富さと、3 dpi での FFA によるウイルス生存率を示しました。 e ビヒクル処理マウス、100 mg/kg ATV014処理マウス、および200 mg/kg ATV014処理マウスの肺の肺切片の代表的なH&E画像。 f CD1 マウスにおける ATV014 の単回静脈内 (1.0 mg/kg) および経口 (5 および 20 mg/kg) 投与後の ATV014 の平均血漿濃度 (グループあたり n = 3)。 SDラット（各グループn = 6）におけるATV014の単回静脈内（1.0 mg/kg）および経口（20、40、および80 mg/kg）投与、および単回静脈内（1 mg/kg）および経口（5、15、および80 mg/kg）投与ビーグル犬に 45 mg/kg) を投与 (1 グループあたり n = 6)。 g ATV014 80 mg/kg を単回経口投与した後の雄ラットにおける主要な代謝産物 GS-441524 の組織分布。 SI: 小腸。 李：大腸。 エラーバーはSEMを示します。 統計分析にはクラスカル・ウォリス検定が使用されました。 ∗P ≤ 0.05; ∗∗P ≤ 0.005; ＊＊＊＊P ≤ 0.0005; ＊＊＊＊P ≤ 0.0001

続いて、参照化合物としてモルヌピラビル (EIDD-2801) を使用して、デルタ変異型感染 K18-hACE2 トランスジェニック マウスにおける経口 ATV014 の in vivo 予防および治療効果を評価しました (図 1c および 1d)。5 この時点で治療が開始されました。予防モデルにおける感染症の解析。 接種後３日（ｄｐｉ）で、ＡＴＶ０１４（１００および３００ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ）で処置したマウスのウイルスＲＮＡコピーは有意に減少した。 FFA (焦点形成アッセイ) で測定した ATV014 処置マウスのウイルス力価は検出限界近くまで減少し、肺内の感染性ウイルスが大幅に排除されたことが示されました。 治療環境における最低有効用量を決定するために、感染の 2 時間後に ATV014 を投与しました。 20、50、100、および200 mg/kgのATV014は、肺内のウイルスRNAを用量依存的に減少させた。 200 mg/kg の ATV014 は、ウイルス RNA を約 2 桁有意に減少させました (溶媒グループの 1.7 × 105 コピー/μl と比較して、1.4 × 103 コピー/μl)。これは、200 mg/kg モルヌピラビルと比較してより強力でした (5.4 × 103コピー/μl）。 病巣形成アッセイでは、50 mg/kg 以上の用量の ATV014 により、感染性ウイルスの濃度が検出限界以下に減少しました。 組織病理学的分析により、ATV014が間質性炎症病変やSARS-CoV-2 デルタ感染によって引き起こされる損傷から肺組織を保護していることが明らかになりました（図1e）。

ATV014 のキロスケールアップ合成プロセスは、臨床研究への供給を確保するために最適化されています。 ATV014 は、結晶性が高く、40 °C/75%RH (開放) および 60 °C (開放) で 30 日間物理的に安定した無水物として得られ、良好な化学的安定性を示しました。 ATV014 は、1.99 という良好な実験結果の log P 値と 3.5 の pKa 値を示しました。 GS-441524 は、Caco-2 細胞透過性アッセイにおいて、Papp (A to B) 値 3.62 cm/s × 10-6 という中程度に低い透過性を示しました。 対照的に、ATV014はメソ高張性化合物（Papp（AからB）= 8.69 cm / s × 10−6）として挙動し、排出速度が2.5の弱い基質排出トランスポーターでした（補足表S3）。 受動的吸収透過性の改善は、ATV014 の経口吸収の改善を部分的に説明します。 SDラットに20、40および80 mg / kgのATV014を単回経口投与した後、バイオアベイラビリティ（F）はそれぞれ49％、43％、および68％でした（図1fおよび補足表S4）。 比較すると、RDV投与後のGS-441524の経口バイオアベイラビリティは、ラットではわずか14％でした（補足表S5）。 一方、ATV014投与後のGS-441524の経口バイオアベイラビリティは、マウスでは66〜69％の範囲、ビーグル犬では78〜105％の範囲でした（図1fおよび補足表S6）。 Cmax と AUC は 3 種すべてで用量依存的に増加しました。 ラット（40 mg/kg、BID）およびイヌ（15 mg/kg、BID）への経口 ATV014 の 7 日間反復投与では、1 日目と 7 日目の AUClast 値と Cmax 値は同等であり、蓄積しなかったことを示しています。繰り返し投与した場合の体内の影響（補足表S7およびS8）。

代謝研究により、ATV014の6つの代謝物がマウスの培養サンプルで検出され、4つがラット、イヌ、ヒトの培養サンプルで、3つがサルの培養サンプルで検出されたことが示されました（補足表S9および図S3）。 加水分解代謝物 M3 (GS-441524) は 5 種すべての肝細胞における主要な代謝物であり、ピーク面積パーセンテージはそれぞれ 93.06%、90.27%、92.45%、96.30%、および 95.64% でした。 さらなる組織分布研究により、一次代謝物GS-441524がラット組織に広く迅速に分布し、特に肺に治療濃度を超えることが示されました。 ATV014、GS-441524、および活性三リン酸型 (RTP) は、87 ターゲットの広範なパネルのスクリーニングにおいて良好なオフターゲット選択性プロファイルを示しました。 ATV014がアデノシントランスポーター活性の53％を阻害したことを除いて、阻害率は、スクリーニングされたすべての標的に対して20μMで50％未満でした（補足表S11）。 単回投与毒性研究では、ATV014 の最大耐用量 (MTD) はラットとイヌの両方で 2000 mg/kg でした。 14 日間の反復投与毒性試験では、ATV014 の無毒性量 (NOAEL) はラットとイヌでそれぞれ 400 mg/kg と 100 mg/kg、MTD は 800 mg/kg と 300 mg/kg でした。 。 ATV014およびGS-441524は、サルモネラ菌、大腸菌を用いたAmes試験および骨髄細胞の小核試験において陰性結果に関して、変異原性または染色異常誘発性を示さなかった。 これらの抗SARS-CoV-2有効性研究と前臨床データにより、ATV014が良好なPK特性と安全性プロフィールを備えた新型コロナウイルス感染症治療用の強力な経口抗ウイルス薬であることが検証され、臨床試験（第1相、NCT05504746；医師主導治験）で調査が進められている。 、ChiCTR2200064093）。

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この研究は、深セン科学技術プログラム (JSGG20200225150431472、JSGG20210901145403012 & KQTD20180411143323605)、広東省基礎応用基礎研究財団 (助成金 #2020A1515110361)、中国国家重点研究開発プログラム (#2) によって支援されました。 021YFC0865100)、主要分野の研究開発広東省 (2021B1111110001) および中国国立自然科学財団 (助成金 #32041002、#82150206) のプログラム。 DG は、Guangdong Zhujiang Talents Program (#2016LJ06Y540) および National Ten-Thousand Talents Program によってもサポートされています。 著者らは、in vivo での有効性実験にご協力いただいた広州税関区技術センターの Lu Zhang、Ruyan Liao、Yongxia Shi、および Jun Dai に感謝します。 また、前臨床研究を支援してくれた南方科学技術大学Medi-X PingshanのGuanguan Li、Shuo Li、Xinjun Liuを含む他のプロジェクト参加者にも感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Qifan Zhou、Sidi Yang、Liu Cao、Yang Yang、Tiefeng Xu

深セン小分子創薬および合成の重要実験室、先端学際研究アカデミーおよびメディエックス坪山理学部化学科、南方科技大学、深セン、広東省、518000、中国

Qifan Zhou、Qishu Chen、Yingjun Li、Xumu Zhang

感染免疫研究センター (CIIS)、中山大学深センキャンパス医学部、深セン、広東省、518107、中国

Sidi Yang、Liu Cao、Tiefeng Xu、Deyin Guo

広州研究所、バイオアイランド、広州、中国

シディ・ヤン & デイン・グオ

深セン病原体免疫重点研究所、国立感染症臨床研究センター、感染症国家重点分野、深セン第三人民病院、南方科技大学付属第二病院、中国深セン

ヤン・ヤン＆ホンジョウ・ルー

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QZ および QC はヌクレオシド プロドラッグを合成しました。 QZ、YL、SY はデータの解釈、図と原稿の作成に参加しました。 SYは動物実験を行った。 LC、TX、YYはウイルスレプリコンと細胞レベルの阻害アッセイを実施した。 YLはPKおよび毒性研究の結果を分析した。 XZ、DG、YL がプロジェクトを発案、設計し、HL とのコラボレーションを開始しました。 DGとXZはスーパーバイザーとしてプロジェクト全体を担当しました。 すべての著者が記事を読んで承認しました。

Yingjun Li、Deyin Guo、または Xumu Zhang との通信。

南方科学技術大学と中山大学は、この研究に関連する特許を申請している。 XZ、DG、LC、Y.Li.、TX、および QZ が本出願の発明者として記載されています。 XZ と DG は新興企業、Shenzhen AntiV Pharma Co., Ltd. の共同創設者です。他の著者は全員、競合する利害関係がないと宣言しています。

すべての動物研究プロトコールは動物福祉委員会によって承認され、動物研究で使用されるすべての手順は、それぞれの研究単位の動物管理使用委員会のガイドラインと方針に準拠しました。

ATV014 の前臨床特性評価と抗 SARS-CoV-2 効果: 1'-CN-4-アザ-7,9-ジデアザアデノシン C-ヌクレオシドの経口シクロヘキサンカルボン酸プロドラッグ

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転載と許可

Zhou、Q.、Yang、S.、Cao、L. 他。 ATV014: 1'-CN-4-アザ-7,9-ジデアザアデノシン C-ヌクレオシドの経口シクロヘキサンカルボン酸プロドラッグの前臨床特性評価と抗 SARS-CoV-2 効果。 Sig Transduct Target Ther 8、27 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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受信日: 2022 年 8 月 11 日

改訂日: 2022 年 12 月 8 日

受理日: 2023 年 1 月 3 日

公開日: 2023 年 1 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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