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May 13, 2023

C11orf54はCMAをブロックすることでDNA修復を促進します

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 606 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

C11orf54 は、さまざまな種にわたって高度に保存されているエステル加水分解酵素です。 C11orf54 は腎臓がんのバイオマーカータンパク質として同定されていますが、その正確な機能はまだよくわかっていません。 今回我々は、C11orf54 ノックダウンが細胞増殖を減少させ、シスプラチン誘発性の DNA 損傷とアポトーシスを増強することを実証します。 一方で、C11orf54の欠失はRad51の発現と核蓄積を減少させ、その結果相同組換え修復が抑制されます。 一方、C11orf54 および HIF1A は HSC70 と競合的に相互作用し、C11orf54 のノックダウンにより HSC70 の HIF1A への結合が促進され、シャペロン媒介オートファジー (CMA) による分解の標的となります。 C11orf54 ノックダウン媒介 HIF1A 分解は、dNTP の生成による DNA 合成と DNA 修復の律速 RNR 酵素であるリボヌクレオチド還元酵素調節サブユニット M2 (RRM2) の転写を減少させます。 dNTP を補給すると、C11orf54 ノックダウンによる DNA 損傷と細胞死を部分的に救済できます。 さらに、マクロオートファジーとシャペロン媒介オートファジーの両方の阻害剤であるバフィロマイシン A1 が、dNTP 治療と同様のレスキュー効果を示すことも発見しました。 要約すると、我々は、CMAを介したHIF1A/RRM2軸の減少を介したDNA損傷と修復の調節におけるC11orf54の役割を明らかにした。

ゲノムの完全性は、ホメオスタシスの維持、正常な発育、がんの予防において重要です1。 内因性ゲノムストレスと外因性ゲノムストレスの両方が DNA 一本鎖切断 (SSB) および DNA 二本鎖切断 (DSB) を引き起こし、能動的 DNA 損傷応答 (DDR) を引き起こします2,3。 DDR 経路は、さまざまな種類の DNA 損傷を感知、信号伝達し、修復します。これはゲノムの安定性を維持するために重要です4。 相同組換え (HR) は、DSB および鎖間架橋 (ICL) のエラーのない相同性指向修復の主要なメカニズムを表します。 Rad51 とそのパラログは、このプロセスにおいて重要な役割を果たします 5,6。 リボヌクレオチド レダクターゼ (RNR) は、DNA 合成に必要なデオキシリボヌクレオチド (dNTP) を触媒します。 2 つのサブユニット RRM1 (リボヌクレオチド レダクターゼ触媒サブユニット M1) と RRM2 (リボヌクレオチド レダクターゼ制御サブユニット M2) は、α2β2 複合体を構成して触媒活性を発揮し、細胞内の dNTP のバランスは細胞の恒常性とゲノムの完全性の維持に不可欠です 7、8、9。 律速 RNR 酵素である RRM2 は、dNTP を生成することによる DNA 合成と DNA 修復に不可欠です 10。

低酸素誘導因子 1 (HIF1) は、代謝、炎症、腫瘍形成などの多くの生物学的プロセスに関与する二量体転写複合体です 11。 HIF1A は HIF1 複合体のサブユニットであり、O2 の存在下で HIF 特異的プロリルヒドロキシラーゼ (PHD) によって修飾されます。 修飾された HIF1A はプロテアソームによって分解され、これには酸素依存性のプロリン水酸化とフォン ヒッペル リンダウ (VHL) 媒介のユビキチン化が必要です 12。 さらに、HIF1A はさまざまな方法で DDR を制御することが報告されています。 P-H2A.X は、DNA 二本鎖切断のマーカーであり、損傷シグナルを増幅し、DNA 損傷修復タンパク質を動員します 13。 がん細胞では、HIF1A のノックダウンにより低酸素誘発性の p-H2A.X 蓄積が減少し、DNA 損傷修復能力と腫瘍治療抵抗性に影響を与えます 14。 低酸素を介した HIF1A の安定化は、hTERT (テロメラーゼ逆転写酵素) と hTR (テロメラーゼ RNA 成分) の転写を促進し、DNA 損傷とゲノム安定性を制御します 15,16。 一方、HIF1A が失われると、DNA 二本鎖切断修復が抑制され、化学療法に対する感受性が高まる可能性があります 17,18。

シャペロン媒介オートファジー (CMA) は、基質がリソソームを直接標的にして分解されるオートファジーの一種です。 CMA 基質タンパク質は、70 kDa の熱ショック同族タンパク質 (HSC70) によって選択的に認識され、リソソームを標的とし、その後 CMA 媒介分解のためにリソソーム膜受容体 2A 型 (LAMP2A) に動員されます 19。 CMA は DNA 修復に関与し、ゲノムの安定性を維持することで悪性形質転換を防ぐ可能性があります 19。 最近の研究では、HIF1A が CMA 基質であり、細胞周期の制御に関与していることが実証されました。 HIF1A は、E3 ユビキチンタンパク質リガーゼ STUB120 によって Lys63 上でユビキチン化されると、CMA 依存的に分解されます。 細胞周期調節因子であるチェックポイントキナーゼ 1 (CHK1) は、もう 1 つの CMA 基質です。 CMA 阻害は、DNA 損傷反応中に Chk1 の核内残留を引き起こし、DNA 損傷の蓄積と DNA 修復の障害を引き起こします 21。

PTD012 としても知られる C11orf54 (染色体 11 オープン リーディング フレーム 54) は、ハツカネズミ、ブラキダニオ レリオ、ショウジョウバエ、および線虫で発現される高度に保存された遺伝子です 22。 ヒト C11orf54 は 3 つのヒスチジン残基に配位した Zn2+ イオンを含み、エステル加水分解酵素活性を示します 22。 さらに、C11orf54 のキイロショウジョウバエオルソログは、栄養過多時のタンパク質恒常性において重要な役割を果たしています 23。 C11orf54 は、質量分析と組み合わせた二次元ゲル電気泳動によって、子宮内膜癌、腎細胞癌、および明細胞腎細胞癌のバイオマーカータンパク質として同定されました 24、25、26。 しかし、哺乳類におけるその機能はまだ不明です。

本研究では、C11orf54 が細胞増殖とアポトーシスを制御していることを発見しました。 C11orf54 をノックダウンすると、ATM 依存性 DNA 損傷応答 (DDR) が活性化され、Rad51 の発現が抑制されて相同組換え修復が阻害されました。 さらに、C11orf54 が HSC70 と競合的に相互作用し、HIF1A と HSC70 間の相互作用を遮断することもわかりました。 したがって、C11orf54 のノックダウンは HSC70 の HIF1A への結合を強化し、シャペロン媒介オートファジーによる HIF1A の分解を引き起こしました。 さらに、バフィロマイシン A1 (BafA1) によって CMA をブロックすると、C11orf54 ノックダウン誘発 DNA 損傷と細胞増殖抑制が部分的に回復する可能性があります。 我々のデータは、C11orf54がCMAを介したHIF1Aの分解をブロックすることによってDNA修復を促進することを実証しました。

C11orf54 の結晶構造から、C11orf54 がエステル加水分解酵素であることが明らかになり、メタロ-β-ラクタマーゼフォールドタンパク質のスーパーファミリーに属する可能性があります 22。 C11orf54 は、ホモ・サピエンス、ハツカネズミ、ブラキダニオ・レリオ、キイロショウジョウバエ、および線虫を含む種間で保存されています。 C11orf54は、ヒト種のさまざまな組織間で普遍的に発現し、特に腎臓および肝臓組織で豊富に発現します（補足図1）。 そこで、293T と肝細胞を用いて C11orf54 の生理機能を調べました。

以前の研究では、自動表現型解析アプローチを使用して、C11orf54 が主に核内に存在することが実証されました 27。 別の研究では、C11orf54 が過剰発現した細胞の細胞質および核で C11orf54 が検出されました 28。 内因性 C11orf54 の正確な細胞内局在を研究するために、検証済みの抗体を使用して核/サイトゾル分画アッセイおよび免疫染色実験を実行しました。 まず、2 つの異なる shRNA (shC11orf54-1、shC11orf54-2) 媒介遺伝子サイレンシングを使用して、C11orf54 ノックダウン細胞を生成しました。 C11orf54 ノックダウン細胞では、C11orf54 のタンパク質および mRNA レベルが大幅に減少しました（図 1a、b）。 次に、ノックダウン細胞でC11orf54を過剰発現させ、C11orf54抗体の特異性を確認しました（図1c）。 ブロットがないことは、C11orf54 ノックダウン細胞株の構築が成功したことを示し、また C11orf54 抗体の特異性を検証しました。 免疫染色実験では、内因性 C11orf54 が主に細胞質に局在していることが示されました (図 1d、e)。 さらに、核/サイトゾル分別アッセイは、C11orf54が主に細胞質分別で観察されるという一貫した結果を示しました（図1f、g）。 これらのデータを総合すると、C11orf54 が主に細胞質に局在していることが示唆されます。

a、b ウェスタンブロット (a) および qPCR (b) 実験は、PLC/PRF/5 細胞株における C11orf54 (shC11orf54-1、shC11orf54-2) のノックダウン効率を示します。 ACTB を対照として使用しました (n = 3 の生物学的複製、データは平均値 ± SD、***p < 0.001)。 c ウェスタンブロットは、C11orf54 ノックダウン細胞における C11orf54 抗体の特異性、および C11orf54 ノックダウン細胞への C11orf54 の再導入を示します。 d 代表的な免疫染色​​画像は​​、野生型細胞における C11orf54 の細胞内局在を確認します。 スケールバー = 20 μm。 e 代表的な免疫染色​​画像は​​、コントロールおよび C11orf54 ノックダウン PLC/PRF/5 細胞における C11orf54 の細胞内局在を確認します。 スケールバー = 10 μm。 f、g 核/サイトゾル分別アッセイは、Proteintech (f) および Invitrogen (g) の 2 つの検証済み抗体を使用した PLC/PRF/5 細胞株における C11orf54 の細胞内局在を示します。 GAPDH を細胞質 (Cyto) マーカーとして使用し、H3 を核 (Nuc) マーカーとして使用しました。

次に、C11orf54 のノックダウンが、生物の発生における重要な細胞事象である細胞増殖とアポトーシスに影響を与えるかどうかを調査しました 29。 CCK8アッセイは、C11orf54サイレンシングがPLC / PRF / 5および293T細胞の増殖（図2a、補足図2a）およびコロニー形成（図2b、cおよび補足図2b、c）を有意に阻害することを示した。 さらに、C11orf54ノックダウン細胞では、対照細胞と比較してEdU陽性細胞の数が大幅に減少していることが検出されました（図2d、e）。 これらの結果は、C11orf54 欠損が細胞増殖を抑制することを示しています。

CCK8アッセイは、コントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC/PRF/5細胞の細胞生存を示します（データは平均値±SD、***p<0.001として表示されます）。 b、c コロニー形成 (b) および定量的結果 (c) は、コントロールおよび C11orf54 ノックダウン PLC/PRF/5 細胞の細胞増殖を示します (n = 3 生物学的複製; データは平均値 ± SD、*p < 0.05、 **p < 0.01)。 d、e EdU染色は、PLC/PRF/5細胞株における細胞増殖に対するC11orf54ノックダウンの効果を確認します。 画像は、EdU 染色 (赤色) と DAPI 染色 (青色) を組み合わせたものを示しています。 (スケールバー = 100 μm; データは平均値 ± SD、***p < 0.001) として表示されます。 f、g 異なる時間（0時間、1時間、6時間、12時間および24時間）、10μMシスプラチンで処理したPLC / PRF / 5細胞におけるC11orf54発現のウェスタンブロット（f）および定量的結果（g）（n） = 3 生物学的複製; データは平均値 ± SD、***p < 0.001) として表示されます。 h 異なる濃度(5μM、20μM、40μM、および100μM)の対照およびC11orf54ノックダウンPLC/PRF/5細胞におけるシスプラチンとのインキュベーション後の生存率アッセイ。 i、j 3 μM シスプラチンで 24 時間処理し、薬物を含まない培地でさらに 10 日間培養した後のシスプラチン感受性に対する C11orf54 ノックダウンのコロニー形成分析 (n = 3 生物学的複製; データは平均値 ± SD、* として表示) **p < 0.001)。 k、l 10μMシスプラチンで48時間処理した後のコントロール細胞およびC11orf54ノックダウン細胞におけるアネキシンV（FITC）/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色によるアポトーシスの分析（L）および定量的結果（K）（n = 4の生物学的複製） ; データは平均値 ± SD、***p < 0.001) として表示されます。 m、n 10 μM シスプラチンで 48 時間処理した後のコントロールおよび C11orf54 ノックダウン PLC/PRF/5 細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット (m) および定量的結果 (n) (n = 3 生物学的複製; データは平均値として表示)値 ± SD、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。

興味深いことに、シスプラチン（CDDP）処理によりC11orf54の発現が時間依存的に増加することがわかりました（図2f、g）。 他の遺伝毒性誘導物質が C11orf54 の発現を調節できるかどうかを調べるために、ヒドロキシ尿素 (HU) およびカンプトテシン (CPT) 処理時の C11orf54 発現を評価しました。 同様に、HU と CPT も時間依存的に C11orf54 の発現を促進する可能性があります（補足図 3a-d）。 これらのデータは、C11orf54 が遺伝毒性誘導物質に応答する可能性があることを示し、C11orf54 が遺伝毒性薬剤誘発性の細胞死において役割を果たしている可能性があることを示しています。 実際、細胞生存率およびコロニー形成アッセイでは、C11orf54ノックダウン細胞が対照細胞よりもシスプラチンに対して感受性が高いことが示されました（図2h–j）。 アネキシン V（FITC）/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色により、シスプラチン誘導性の初期および後期アポトーシスがC11orf54ノックダウン細胞で増加したことが示されました（図2k、l）。 TUNELアッセイは、C11orf54の喪失がシスプラチン治療下でアポトーシスを促進することも実証しました（補足図3e、f）。 さらに、C11orf54のノックダウンにより、アポトーシスの実行において中心的な役割を果たすカスパーゼ3とPARP1の切断が強化されることがわかりました（図2m、n）。 興味深いことに、カスパーゼ 3 活性化に対する C11orf54 の効果はシスプラチンの存在下でのみ見られたが、これはシスプラチンが C11orf54 ノックダウン後のアポトーシス傾向を増強するためである可能性がある。 一方、C11orf54ノックダウン細胞では、アポトーシス促進性BAXの増加と抗アポトーシス性Bcl-2の減少が観察されました（図2m、n）。 総合すると、これらの結果は、C11orf54 欠損が細胞増殖を抑制し、アポトーシスを促進することを示しています。

遺伝毒性薬は、DNA 合成の阻害または DNA 構造の破壊によって細胞死を引き起こします。 我々の結果は、C11orf54のタンパク質レベルが遺伝毒性薬物治療後に増加したことを示し（図2f、g、および補足図3a〜d）、C11orf54がゲノム安定性またはDNA損傷に関与している可能性があることを示しています。 C11orf54 が薬物誘発性 DNA 損傷に関与しているかどうかを調べるために、コメット アッセイを使用して、シスプラチン治療後の二本鎖切断 (DSB) を検出しました。 テールDNAおよびテールモーメントで示されるDNA断片は、シスプラチン処理後のC11orf54ノックダウン細胞で劇的に増加しました（図3a〜c）。 さらに、DNA 損傷のマーカーとして認識される γH2A.X (p-H2A.X-Ser139) レベル 30 を免疫蛍光染色とウェスタンブロットアッセイによって調べました。 C11orf54 サイレンシングは、対照細胞と比較して、シスプラチンおよび通常の両方の条件下で γH2A.X 病巣の数 (図 3d、e) およびタンパク質レベル (図 3f、g) を有意に増加させました。 これらの結果は、C11orf54 のノックダウンが DNA 損傷を促進することを示唆しています。

a – c コントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC / PRF / 5細胞（a）および尾部DNA％（b）および尾部モーメントの定量化（c）におけるコメットアッセイの代表的な画像（n = 20の独立した細胞。データは平均値として表示）値 ± SD; ***p < 0.001)。 スケールバー = 30 μm。 d、e コントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC / PRF / 5細胞におけるγH2A.X病巣の代表的な画像（d）および定量的結果（e）（n = 10の独立した細胞;データは平均値±SDとして表示されます; *p < 0.05 、***p < 0.001)。 スケールバー = 10 μm。 f、g 10μMシスプラチンで6時間処理したときのコントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC/PRF/5細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット（f）および定量的結果（g）（n = 3の生物学的複製;データは平均値として表示） ± SD; *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。 h、i 10μMシスプラチンおよび10μMシスプラチン+10μM KU-60019を6時間加えたコントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC/PRF/5細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット（h）および定量的結果（i）（n = 3）生物学的複製; データは平均値 ± SD として表示されます; *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。

ATM (毛細血管拡張性失調症変異) は、DDR 経路の最上流キナーゼの 1 つであり、その活性化により、Chk1 や Chk231、32、33、34 などの一連のキナーゼのリン酸化が引き起こされます。 C11orf54のノックダウンにより、通常条件およびシスプラチン処理下でATMおよびその下流Chk1 / Chk2のリン酸化が促進されることがわかりました（図3f、g）。 293T細胞でも同じ現象を観察することができました（補足図2d）。 さらに、ATMキナーゼ阻害剤KU-60019は、コントロール条件またはシスプラチン処理条件の両方で、C11orf54ノックダウン細胞におけるp-ATM、p-CHK1、p-CHK2、およびp-H2A.Xの発現増加を部分的に抑制できました（図3h、i）。 。 これらのデータは、C11orf54 のノックダウンが ATM 依存性経路における DNA 損傷を活性化することを示唆しています。

DNA 修復は、内因性または外因性の原因からの DNA 損傷を修復してゲノムの完全性を維持できる、進化的に保存された経路です 35,36。 私たちは、C11orf54 が DNA 修復欠損を調節しているかどうか疑問に思いました。 まず、相同組換え (HR) と非相同末端結合 (NHEJ) における 2 つの重要なタンパク質である Rad51 と Ku70 の発現をそれぞれ検出しました。 C11orf54のノックダウンはRad51の発現を有意に抑制したが、Ku70の発現は抑制しなかったことを発見し（図4a、b）、免疫染色実験ではC11orf54の欠失が核内のRad51病巣形成を阻害したことを示した（図4c、d）。相同組換えに関与します。 したがって、我々は、HRレポーターシステムを使用して、C11orf54ノックダウン細胞および対照細胞における相同組換え修復活性を評価しました。 このシステムでは、GFP は I-SceI 部位によって中断され、I-SceI 発現後に下流の GFP を鋳型として使用する HR 修復によって機能的な GFP を復元できます 37。 pDR-GFP と pCBA-SceI を C11orf54 ノックダウン細胞とコントロール細胞に同時トランスフェクトし、フローサイトメトリーで GFP 陽性細胞を記録しました。 C11orf54ノックダウン細胞ではGFP陽性細胞の割合が大幅に減少していることがわかり（図4e、f）、C11orf54のノックダウンがHR修復活性を抑制したことを示しています。 さらに、対照細胞と比較して、C11orf54ノックダウン細胞は、シスプラチン治療を中止した後、p-H2A.X病巣のクリアランスが遅いことを示しました（図4g、h）。 総合すると、これらのデータは、C11orf54 のノックダウンにより相同組換え修復が損なわれ、DNA 損傷が増強されることを示唆しています。

a、b 10 μM シスプラチンで 6 時間処理したときのコントロールおよび C11orf54 ノックダウン PLC/PRF/5 細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット (a) および定量結果 (b) (n = 3 の生物学的複製。データは平均値として表示) ± SD; ***p < 0.001 )。 c、d シスプラチン処理後の指定された時点でのRad51病巣の代表的な画像（d）およびコントロールおよびC11orf54ノックダウン細胞における定量的結果（c）（n = 10の独立した細胞;データは平均値±SDとして表示されます; ** p < 0.01)。 スケールバー = 10 μm。 e、f pDR-GFPとpCBA-SceIを共トランスフェクトした後のコントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC / PRF / 5細胞におけるGFP陽性細胞のフローサイトメトリー分析（e）および定量的結果（f）（n = 3の生物学的複製。 ***p < 0.001)。 g、h シスプラチン処理後の指定の時点でのコントロールおよびC11orf54ノックダウンPLC / PRF / 5細胞におけるp-H2A.X病巣の代表的な画像（g）および定量的結果（h）（n = 10の独立した細胞;データは平均値 ± SD として表示; *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。 スケールバー = 10 μm。

C11orf54 ノックダウン媒介相同組換え修復障害の潜在的なメカニズムを特定するために、ハイスループット RNA シーケンス (RNA-Seq) によって C11orf54 ノックダウン細胞と対照細胞のトランスクリプトームを分析しました。 C11orf54ノックダウン細胞において708個の有意に差次的に発現される遺伝子（303個の上方制御遺伝子および405個の下方制御遺伝子）を同定し、これらを火山プロットによって視覚化した（図5a）。 さらに、KEGG データベースを使用して DEG (Differentially Expressed Genes) の機能解析を実行しました。 有意に下方制御された上位 20 の KEGG 経路を図 5b にリストしました。 C11orf54ノックダウン細胞では、解糖/糖新生およびHIF1シグナル伝達経路が下方制御されていました（図5b）。 一貫して、GSEAの結果は、低酸素症（NES = -1.4、p値 = 0.005）および解糖-糖新生（NES = -1.5、p値 = 0.011）に関連する遺伝子セットがpLKO.1グループに豊富であることを示しました（図1）。 5c)。 HIF1A は、解糖および解糖遺伝子の転写を調節する既知の転写因子です 38。 そこで、C11orf54 ノックダウン細胞における HIF1 標的遺伝子および解糖・糖新生関連遺伝子の発現を評価しました。 qPCR の結果は、C11orf54 ノックダウン細胞では、ほとんどの解糖関連遺伝子 (GLUT1、GLUT2、PGK1、ENO1、PDK3、LDHA、PDHA1) と糖新生関連遺伝子 (FBP1 および PEPCK) が大幅に減少していることを示しました (図 1)。 5d）。 さらに、C11orf54のノックダウンは、PKM2、HK2、LDHA、PFKP、およびHIF1Aのタンパク質レベルを有意に抑制しました（図5e、f）。 これらのデータは、C11orf54 のノックダウンが HIF1A シグナル伝達経路を抑制することを示しています。

C11orf54 ノックダウン対コントロールサンプルで有意に変化した遺伝子を示す火山プロット (赤点: 上方制御された遺伝子、青点: 下方制御された遺伝子、灰色の点: 有意な変化なし遺伝子)。 b C11orf54 ノックダウン対コントロールサンプルの DEG の分析で見つかった、機能的に富化された上位 20 の KEGG 経路。 c 遺伝子セット濃縮分析（GSEA）は、低酸素症および解糖・糖新生シグナル伝達経路が C11orf54 ノックダウングループを濃縮する傾向があることを示しています。 d C11orf54ノックダウン細胞およびコントロール細胞における解糖遺伝子のmRNA発現のqPCR実験分析（n = 4の生物学的複製、データは平均値±SDとして表示されます、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001）。 e、f C11orf54 ノックダウン細胞およびコントロール細胞における解糖タンパク質のウェスタンブロット (e) および定量的結果 (f) (n = 4 生物学的複製; データは平均値 ± SD、*p < 0.05、**p < 0.01) ）。

次に、HIF1A のどの下流標的が C11orf54 ノックダウン細胞の DNA 修復に関与しているか疑問に思いました。 解糖系と DNA 修復経路との相互作用は依然として不明であるが、解糖系が DNA 代謝に必須の代謝産物を提供することでゲノムの安定性を維持している可能性があることがいくつかの研究で示唆されている 39。 たとえば、ペントースリン酸経路 (PPP) は、ヌクレオチドと NADPH を合成して DNA 損傷を軽減するために、解糖中間体 (グルコース-6-リン酸) をリボース-5-リン酸に変換します 40,41。 したがって、C11orf54 ノックダウン細胞およびコントロール細胞における NADPH/NADP+ 比 (PPP のよく知られたバイオマーカー) およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (PPP の律速酵素) の発現を評価しました。 ただし、C11orf54ノックダウン細胞とコントロール細胞の間でNADPH / NADP +比とG6PD発現に差はなく（補足図4a、b）、C11orf54媒介DNA損傷のノックダウンが解糖経路を通らない可能性があることを示唆しています。

C11orf54 が DNA 損傷修復をどのように制御するかをさらに調べるために、DNA 修復に関与する遺伝子の mRNA レベルを測定しました。 図6aに示すように、候補遺伝子のほとんどの転写レベルは、RRM2を除いて変化しませんでした。 さらに、RRM2のタンパク質レベルは、シスプラチン条件下とコントロール条件下の両方でC11orf54ノックダウン細胞で有意に減少しました（図6b、c）。 リボヌクレオチド還元酵素の小サブユニットである RRM2 は、dNTP を生成することによる DNA 合成と修復に不可欠です 42。 HIF-1α/STAT3 シグナル伝達経路が RRM2 転写レベルを上方制御する可能性があることが報告されています 43,44。 したがって、ヌクレオシドの補給が C11orf54 ノックダウン誘発 DNA 損傷を救済できるかどうかを判断しました。 ヌクレオシドの補給により、C11orf54ノックダウン細胞のγ-H2AX病巣が部分的に減少しました（図6d、e）。 さらに、C11orf54ノックダウン細胞における抑制されたコロニー形成も、ヌクレオシド補充によって部分的に回復した(図6f、g)。 これらの結果は、C11orf54 ノックダウンが HIF1A /RRM2 軸を抑制することによって DNA 損傷を引き起こすことを示唆しています。

C11orf54 ノックダウン細胞およびコントロール細胞における HIF1A 下流 DNA 修復標的遺伝子の mRNA 発現の qPCR 分析 (n = 4 生物学的複製、データは平均値 ± SD、***p < 0.001)。 b、c 10μMシスプラチンで6時間処理したときのコントロールおよびC11orf54ノックダウン細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット（b）および定量結果（c）（n = 4の生物学的複製;データは平均値±SD、**として表示） *p < 0.001)。 d、e 100μM dNTPで24時間処理したときの対照およびC11orf54ノックダウン細胞におけるγH2A.X病巣の代表的な画像（d）および定量的結果（e）。 (n = 10 の独立した細胞; データは平均値 ± SD として表示; **p < 0.01、***p < 0.001)。 スケールバー = 10 μm。 f、g コロニー形成（f）および定量的結果（g）は、24時間の100μM dNTP処理下でのC11orf54ノックダウンPLC / PRF / 5細胞および対照細胞の細胞増殖を示します（n = 3の生物学的複製;データは平均値として表示）値 ± SD、*p < 0.05、**p < 0.01)。

次に、C11orf54 がどのように HIF1A 発現を調節するかを調べました。 C11orf54ノックダウンはHIF1のmRNAレベルに影響を及ぼさないため（図6a）、HIF1Aの分解を評価しました。 まず、細胞を PHD 阻害剤 CoCl2 で処理したところ、HIF1A の安定化と蓄積が起こりました。 しかし、C11orf54ノックダウンはCoCl2処理時にHIF1A発現を一貫して減少させ（補足図5a）、C11orf54抑制されたHIF1AのノックダウンがHIF1A安定化の制御を介していない可能性があることを示唆しています。 次に、MG132 と BafA1 を使用して、C11orf54 のノックダウンがプロテアソームまたはオートファジー - リソソーム経路を介して HIF1A 分解を引き起こすかどうかを疑問に思いました。 BafA1処理後にHIF1A発現は回復したが、MG132処理後には回復しなかったことを我々は見出した（図7a、b）。 BafA1 はオートファゴソームとリソソームの融合およびオートリソソームの酸性化に対して広く使用されている阻害剤であり、C11orf54 がオートファジー依存的に HIF1A 分解を促進する可能性があることが示唆されています。

a、b 10 μM MG132 および 100 nM BafA1 で 8 時間処理したときのコントロール細胞および C11orf54 ノックダウン細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット (a) および定量結果 (b) (n = 4 生物学的複製。データは平均値 ± として表示) SD、***p < 0.001)。 c、d HBSSおよび1μMラパマイシンで12時間処理したときのコントロールおよびC11orf54ノックダウン細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット（c）および定量結果（d）（n = 4の生物学的複製;データは平均値±SDとして表示されます） ***p < 0.001)。 e、f 通常および100 nM BafA1で8時間処理した48時間のトランスフェクション後のコントロールおよびC11orf54ノックダウン細胞におけるGFP-LC3点状の代表的な画像（e）および定量的結果（f）。 (スケールバー = 20 μm; データは平均値 ± SD、*p < 0.05、***p < 0.001) として表示されます。 g CCK8 アッセイは、通常および 0.5 nM BafA1 で 12 時間前処理したときの C11orf54 ノックダウン PLC/PRF/5 細胞およびコントロール細胞の細胞生存を示します (データは平均値 ± SD、***p < 0.001)。 h、i コロニー形成 (h) および定量的結果 (i) は、通常および 0.5 nM BafA1 で 12 時間前処理した場合の C11orf54 ノックダウン PLC/PRF/5 細胞およびコントロール細胞の細胞増殖を示します (n = 4 の生物学的複製、データを示します)平均値±SD、**p < 0.05、***p < 0.001)。

実際、C11orf54ノックダウンは、飢餓およびラパマイシン処理時にLC3B-II/Iの比を有意に増加させ、オートファジー基質p62を減少させた（図7c、d）。 さらに、オートファゴソームGFP-LC3点の数は、通常およびBafA1処理条件下のC11orf54ノックダウン細胞で増加しました（図7e、f）。 さらに、BafA1で前処理すると、C11orf54ノックダウン細胞の細胞生存率とコロニー形成能力を回復できました（図7g-i）。 ただし、オートファジーの初期段階を抑制するPI3K阻害剤（ウォルトマニンおよび3-MA）の処理では、C11orf54ノックダウン細胞のHIF1Aのタンパク質レベルを回復できませんでした（補足図5b、c）。 逆に、リソソーム阻害剤（NH4Cl）で処理すると、HIF1Aの発現をレスキューすることができます（補足図5d）。 これらの結果は、C11orf54 のノックダウンにより、オートファジーおよびリソソームの後期段階を通じて HIF1A 発現が減少することを示唆しています。

最近の研究では、HIF1A には KFERQ 様モチーフが含まれており、これが HSC70 によって認識されて結合され、シャペロン媒介オートファジー (CMA) 分解のためにリソソーム上の LAMP2A 多量体複合体を標的とすることが示されました 45。 したがって、我々は、C11orf54 がシャペロン媒介オートファジーを介して HIF1A 分解を調節しているかどうか疑問に思っています。 まず、CMA 機構のコアコンポーネント (HSC70 および LAMP2A) の発現を検出しました。 ただし、C11orf54は、HSC70およびLAMP2AのmRNAおよびタンパク質レベルに影響を与えません（補足図6a〜d）。

次に、C11orf54 が HIF1A のリソソームへのターゲティングとその後の CMA 媒介分解に影響を与えるのではないかと推測しました。 したがって、免疫共沈降/質量分析（Co-IP/MS）アッセイを実行して、C11orf54と相互作用する可能性のあるタンパク質を特定しました（補足図6e）。 上位に同定された C11orf54 相互作用タンパク質リストは、タンパク質間相互作用 (PPI) ネットワークを構築するために STRING オンライン データベースにアップロードされました。 次に、最大クリーク中心性（MCC）アルゴリズムとCytoscapeソフトウェアによるcytoHubbaプラグインを使用してPPIネットワークから選択されたハブ遺伝子を図8aに示します。 上位 5 つのハブ遺伝子は、HSPA8、HSPA5、HSP90AA1、HSP90AB1、および HSPA9 でした (図 8a、b)。 HSPA8 と HSP90AA1 は両方ともリソソーム膜に局在し、そこから CMA46 のさまざまなステップを調節します。 HSPA8 (HSC70) は、CMA46 の基質ターゲティングを担当します。 内因性共免疫沈降アッセイにより、C11orf54はHSC70と相互作用するが、LAMP2とは相互作用しないことが確認された（図8c）。 さらに、KFERQ finder V0.8オンラインソフトウェアにより、C11orf54にはリン酸化活性化モチーフとアセチル化活性化モチーフにそれぞれ属する2つのKFERQ様モチーフが含まれていることを認識しました（補足表3）。 HIF1A には KFERQ 様モチーフが含まれており、これは HSC70 によって認識され相互作用される可能性があります。 したがって、我々は、C11orf54 および HIF1A が HSC70 と競合的に相互作用するという仮説を立てました。 HIF1AとHSC70の間の相互作用は、C11orf54の存在下で抑制されました（図8d）。 一方、HIF1AとHSC70の結合は、C11orf54発現の増加とともに弱まりました（図8e）。 さらに、HIF1A と HSC70 の間の相互作用は、おそらく HIF1A 発現の減少により、C11orf54 ノックダウン細胞では減少しました。 BafA1で処理すると、HIF1Aの発現とHSC70との相互作用が回復しました（図8f）。 さらに、HIF1Aの発現は、C11orf54とLAMP2Aの二重ノックダウンによって回復しました（図8g）。 まとめると、これらのデータは、C11orf54 のノックダウンが、HIF1A と HSC70 の間の相互作用を強化することにより、CMA 媒介 HIF1A 分解を促進することを示しています。

a Co-IP MSによって同定されたC11orf54結合タンパク質のタンパク質間相互作用ネットワーク分析。 b HSPA8 画像の質量スペクトル。 c PLC / PRF / 5細胞由来の全細胞溶解物（WCL）および抗C11orf54の免疫沈降/免疫ブロット分析。 IgGはネガティブコントロールとして機能しました。 d Flag-HIF1AおよびFlag-HIF1Aとpk-Myc-C11orf54を48時間トランスフェクトした293T細胞に由来する全細胞溶解物（WCL）および抗Flagの免疫沈降/免疫ブロット分析。 IgG はネガティブコントロールとして機能しました (n = 3 生物学的複製)。 e Flag-HIF1A、HA-HSC70および勾配pk-Myc-C11orf54で48時間トランスフェクトした293T細胞に由来する全細胞溶解物（WCL）および抗Flagの免疫沈降/免疫ブロット分析。 IgG はネガティブコントロールとして機能しました (n = 3 生物学的複製)。 f 対照および100 nM BafA1で8時間処理したPLC / PRF / 5細胞に由来する全細胞溶解物（WCL）および抗HIF1Aの免疫沈降/免疫ブロット分析。 IgG はネガティブコントロールとして機能しました (n = 3 生物学的複製)。 g コントロール、C11orf54 ノックダウン細胞および C11orf54、LAMP2A ダブルノックダウン細胞における示されたタンパク質のウェスタンブロット。

この研究では、哺乳類における C11orf54 の新しい生物学的効果を詳述することを目的としました。 我々は、C11orf54 ノックダウンにより細胞増殖が減少し、シスプラチン誘発 DNA 損傷とアポトーシスが増強されることを実証しました。 機構的には、C11orf54 および HIF1A は、シャペロン媒介オートファジーの重要なエフェクターである HSC70 と競合的に相互作用し、C11orf54 のノックダウンは CMA 媒介の HIF1A 分解を促進します。 さらに、C11orf54 ノックダウンを介した HIF1A 分解は、dNTP 生成による DNA 合成と DNA 修復の律速 RNR 酵素であるリボヌクレオチド還元酵素調節サブユニット M2 (RRM2) の転写を減少させた。 dNTP を補充すると、C11orf54 ノックダウンによる DNA 損傷と細胞死を部分的に救済できる可能性があります。 さらに、オートファジー阻害剤BafA1がHIF1Aのタンパク質レベルとRRM2のmRNAレベルを回復し、C11orf54ノックダウン細胞の細胞増殖の低下を回復できることを発見しました。 一方、C11orf54の欠失はRad51の発現と核蓄積を減少させ、その結果相同組換え修復が抑制された（図9）。

一方で、C11orf54 の喪失により、Rad51 の発現と核内蓄積が減少します。 一方、C11orf54 をノックダウンすると、HSC70 の HIF1A への結合が促進され、シャペロン媒介オートファジー (CMA) による分解の標的となり、RRM2 の下方制御が引き起こされます。 最終的に、C11orf54 の欠如により相同組換え修復が抑制されます。

C11orf54 はさまざまな種において非常に保存的な遺伝子であり、腎臓および肝臓組織に豊富に存在します。 C11orf54 の生物学的役割は不明であり、細胞内局在については依然として議論の余地がありました。 コンラッドら。 は、自動表現型解析アプローチによってその核の位置を明らかにしました27。 しかし、C11orf54 は主に細胞質に局在しており、C11orf54-eGFP をトランスフェクトすると細胞質と核の両方に存在する可能性があります 28。 ここでは、核/サイトゾル分画アッセイおよび免疫染色分析により、2 つの検証済み抗体を使用して内因性 C11orf54 の局在をテストしました。 結果は、C11orf54が主に細胞質に存在することを示しました（図1d–g）。 C11orf54 は、質量分析と組み合わせた二次元ゲル電気泳動によって、子宮内膜癌、腎細胞癌、および明細胞腎細胞癌のバイオマーカータンパク質として同定されました 24、25、26。 しかし、C11orf54は、対応する正常組織と比較して、腎細胞癌組織において下方制御されていた24、25、26。 さらに、GEPIAウェブサイトを使用してTCGAデータに基づいていくつかのがん組織サンプルにおけるC11orf54の発現を分析したところ、C11orf54はほとんどのがん組織、特にKICH（腎臓嫌色性細胞）、KIRP（腎臓腎乳頭細胞がん）で発現が低いことがわかりました。 ）、およびSARC（肉腫;補足図7）。 私たちの研究では、C11orf54 のノックダウンは DNA 損傷を引き起こし、増殖を阻害する可能性があります (図 2-3)。 これらは、c11orf54 発現が未知のメカニズムを通じて癌組織で減少していることを示唆しており、これは腫瘍細胞の生存をブロックするフィードバック ループである可能性があります。

相同組換え (HR) と非相同末端結合 (NHEJ) は DSB 修復の主要な経路です。 Rad51 と Ku70 はそれぞれ 2 つの主要な調節因子です47、48。 私たちの研究では、C11orf54 ノックダウンは ku70 ではなく Rad51 の発現を阻害し、これは C11orf54 が HR 修復に影響を与える可能性があることを示唆しています。 我々は HR レポーターシステムを使用し、C11orf54 のノックダウンが相同組換え能力を阻害することを発見しました。 一方、C11orf54 ノックダウン後、回復の時間経過に伴う p-H2A.X 病巣の除去は阻害されました。

プロテオミクス研究では、C11orf54 相同タンパク質がインスリン抵抗性マウスの骨格筋で増加していることが示されており、これがタンパク質のフォールディング/分解シグナル伝達経路に関連している可能性があることが示唆されています 49。 我々の結果は、C11orf54欠損がマクロオートファジー基質p62の分解とLC3-IIの蓄積を促進し、これはマクロオートファジーの活性化を意味することを示しています（図6c〜f）。 オートファジー - リソソーム経路は、細胞内タンパク質分解の 2 つの主要な経路のうちの 1 つです50。

さらに、C11orf54のノックダウンがCMA媒介HIF1A分解を促進することもわかりました（図7c-f）。 機構的には、C11orf54 は HSC70 と競合的に相互作用して、HIF1A-HSC70 相互作用を解離させることができます。 C11orf54をノックダウンすると、HSC70との相互作用が消失し、その結果、HSC70とHIF1Aの間の相互作用が強化され、最終的にCMA薬によるHIF1A分解が促進されました（図8e、f）。 一貫して、以前の研究では、HIF1A が HSC70 および LAMP2A45 との相互作用を介して CMA によって分解される可能性があることが示されました。 以前の研究では、マクロオートファジーとシャペロン媒介オートファジーがタンパク質分解において相補的であることが示されています51。 最近の研究では、細胞がストレスの多い刺激に遭遇すると、マクロオートファジーと CMA が活性化される可能性があることが示唆されています 52,53。 今回、我々はC11orf54の欠失によりマクロオートファジーとシャペロン媒介オートファジーの両方が活性化される可能性があることを証明したが、C11orf54がオートファジーをどのように制御するのかのメカニズムはまだ不明であり、今後の研究でさらなる研究が必要である。

以前の研究では、HIF1A/STAT3 シグナル伝達の活性化により RRM2 mRNA 発現が上方制御されることが明らかになり 44、BafA1 による HIF1A 分解の阻害により RRM2 を mRNA レベルで部分的に救済できることも発見しました。 RRM2 レベルは細胞周期中に変動し、G1 期後期/S 期初期に増加し、S 期後期に分解されます。 RRM2 レベルは、APCCdh1 ユビキチンリガーゼによって抑制され、G1 期における RRM2 の蓄積を防ぎます 54。 さらに、G2 期では、CDK を介したリン酸化に続き、RRM2 が Cylin F55 を介して分解されます。 さらに、最近の研究では、siRNA または RNR 阻害剤ヒドロキシ尿素による処理による RRM2 の下方制御により、オートファジーが実質的に誘導されることが示されました。 ただし、RRM2 は、オートファジーの誘導時にプロテアソーム依存性ではあるがオートリソソーム非依存性の分解の標的となります 56。 我々の結果は、C11orf54ノックダウンがmRNAおよびタンパク質レベルの減少を通じてRRM2レベルを低下させることを示しました（図6a〜c）。 dNTP の補充は Rad51 発現を回復させることはできませんでしたが、C11orf54 ノックダウン媒介 DNA 損傷と細胞増殖を部分的に回復させることはできました。これは、HR に影響を与える別のメカニズムがある可能性があることを意味します。 一方、C11orf54をノックダウンするとオートファジーが促進されます（図7）。 ヒドロキシ尿素は、RRM257 のフリーラジカルと鉄中心を還元することにより、十分に確立された RNR 阻害剤です。 私たちの研究では、ヒドロキシ尿素、カンプトテシンおよびシスプラチンは、時間依存的にC11orf54の発現を促進します（図2f、gおよび補足図3a〜d）。 したがって、C11orf54、RRM2、およびオートファジーの間の正確な制御ネットワークが何かについても、さらなる研究が必要です。

要約すると、我々は、CMAを介したHIF1Aの分解を介したDNA損傷と修復の調節におけるC11orf54の役割を明らかにし、その結果RRM2の減少をもたらした。 C11orf54はHSC70と競合的に相互作用し、HIF1A標的によるCMA分解を抑制することができた。 BafA1 または dNTP 処理は、C11orf54 ノックダウン媒介 DNA 損傷および増殖阻害を部分的に救済する可能性があります。

PLC/PRF/5 および 293T 細胞は、中国科学院、タイプカルチャーコレクション委員会、上海細胞バンクから購入しました。 これらの細胞はすべて、10％ウシ胎児血清（Hyclone）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、37℃、5％CO2下で増殖させた。

過剰発現プラスミドの場合、補足表 1 にリストされている PCR 増幅プライマーを使用して、293T 細胞 cDNA から C11orf54 CDS をクローニングしました。pk-Myc ベクターを BamHI および NotI で消化してベクターを直線化し、C11orf54 CDS と直線化したベクターを T4 リガーゼで連結しました。 。

shRNA 設計では、BLOCK-iT™RNAi Designer (http://rnaidesigner.thermofisher.com/) を使用して、C11orf54 の上位 2 つのターゲットを決定します。 2 つのターゲット配列は次のとおりです。

shC11orf54-1: 5'-GGTGCCTACTGGAGAAAATACA-3';

shC11orf54-2: 5'-CCAGGTCTCTGTAGTTGATTG-3'。

pLKO.1ベクターをEcoRIおよびAgeIで消化し、T4リガーゼでshRNAオリゴと連結した。

レンチウイルスを調製するために、ポリエチレンイミン (PEI) トランスフェクション試薬を使用して、shC11orf54 プラスミドを psPAX2 および pMD2.G とともに 293T 細胞に同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの 48 時間後および 72 時間後にレンチウイルス上清を採取し、PLC/PRF/5 細胞および 293T 細胞に感染させました。 感染３日後に細胞を１μｇ／ｍｌピューロマイシン含有培地中で選択した。

メーカーの指示に従い、RNAiso Plus 試薬 (TaKaRa) を使用して細胞から全 RNA を抽出しました。 製造業者の指示に従って、ABScript II First Strand Synthesis Kit (Abclonal) を使用して、RNA を cDNA に逆転写しました。 定量的逆転写 PCR (qRT-PCR) は、CFX96 リアルタイム システム (Bio-Rad) で SYBR Green Master Mix (Abclonal) を使用して実行されました。 相対的な mRNA レベルは、Actb を内部対照として使用し、2-ΔΔCt 法を使用して計算されました。 標的遺伝子のプライマー配列を補足表 1に示します。

タンパク質をプロテイナーゼ阻害剤を含む氷冷RIPA緩衝液(Beyotime)中で単離し、タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ(BCA)によって測定した。 タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ(二フッ化ビニリデン)膜(Millipore)上にエレクトロブロットし、一次抗体および二次抗体でプローブした。 使用した一次抗体と二次抗体を補足表 2 に示します。抗体によって検出されたタンパク質バンドは、増強された化学発光 (Beyotime) によって視覚化し、Image J を使用して評価しました。

細胞をカバーガラス上で 60% コンフルエントになるまで増殖させました。 処理後、細胞を 4% パラホルムアルデヒドを用いて室温で 20 分間固定しました。 抗原へのアクセス可能性は、0.2% Triton X-100 での処理により増加し、3% ウシ血清アルブミンでブロックされました。 細胞を一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 PBSTで洗浄した後、Alexa Fluor 594結合抗ウサギIgGで暗所、室温で1時間染色した。 DAPI 染色後、細胞を Leica TCS SP8 共焦点顕微鏡で画像化しました。 共局在化の定量化のために、メディアン フィルター処理された画像と背景を差し引くことで画像が前処理され、その後、画像は Image J に進みました。

核／細胞質分画アッセイは、核および細胞質タンパク質抽出キット（Beyotime）を製造業者の指示に従って使用して実施した。 簡単に説明すると、2 × 106 個の細胞を細胞質抽出試薬 A と 5 秒間ボルテックスし、氷上で 15 分間インキュベートしました。 細胞質抽出試薬 B を加え、5 秒ボルテックスした後、氷上で 1 分間インキュベートし、4 °C、12,000 g で 5 分間遠心分離しました。 上清をサイトゾル分画した。 次いで、核ペレットを氷冷PBSで3回洗浄し、核抽出試薬で再懸濁し、2分ごとに30秒間、合計30分間ボルテックスした。 4℃、12,000gで10分間遠心分離し、上清を核分画した。

PLC/PRF/5 細胞と 293T 細胞を 10 cm ディッシュに播種し、指定のプラスミドでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 2 日後、細胞を氷上でウェスタン/IP バッファーで溶解し、超音波処理しました。 タンパク質濃度はビシンコニン酸アッセイ (BCA) で測定しました。 Flag または HIF1α 抗体を使用して内因性 HSC70 を免疫沈降しました。 沈殿を煮沸し、IP 検出用の二次抗体 VeriBlot を使用したウェスタンブロット用の SDS-PAGE ゲルにロードしました。

細胞アポトーシスは、製造業者の指示に従って、Annexin V-FITC アポトーシス検出キット (Beyotime) を使用したフローサイトメトリーによって評価されました。 簡単に説明すると、処理後の細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、結合緩衝液に再懸濁し、暗所で室温で20分間、染色溶液(アネキシンV/PI = 2:1)とともにインキュベートした。 アネキシン V/PI 染色の直後に、BD FACS VERSE を使用して蛍光活性化セルソーティング (FACS) 分析を実行しました。

TUNEL染色は、ワンステップTUNELアポトーシスアッセイキット(Beyotime)を製造業者の指示に従って使用した。 簡単に説明すると、24 時間のシスプラチン処理後、細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 20 分間固定し、次に 0.2% Triton X-100 で室温で 5 分間透過処理しました。 PBSで洗浄した後、細胞をTUNEL試験溶液(標識緩衝液/TdT酵素=9:1)とともに暗所、37℃で60分間インキュベートします。 最後に、Zeiss Axio Imager.Z2 を使用して細胞をイメージングしました。

CCK-8 (Solarbio) を製造業者の指示に従って細胞増殖を評価するために使用した。 簡単に説明すると、細胞を 1 × 103 細胞/ウェルの密度で 96 ウェル プレートに播種し、インキュベーターで 24 時間培養した後、それぞれ -1、-2、-3、-4、-5 日目に評価しました。 。 次に、CCK-8溶液を各ウェルに滴下し、プレートをインキュベーターに移し、2時間放置した。 最後に、450 nm での OD 値が MD SpectraMax 190 によって検出されました。

約 1 × 103 個の pLKO.1 および shC11orf54 PLC/PRF/5 細胞を 6 ウェル プレートに播種し、指定濃度のシスプラチンで処理しました。 細胞を10日間培養し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、0.5%クリスタルバイオレットで1時間染色した。 実体顕微鏡を使用してコロニーの数 (> 50 細胞/コロニー) をカウントし、image J ソフトウェア 58 で分析しました。 すべてのサンプルは 3 回繰り返して行われました。

EdU 染色は、製造業者の指示に従って BeyoClick™ EdU-594 キット (Beyotime) を使用しました。 簡単に説明すると、10 μM EdU を新鮮な培地に添加し、細胞が 80% コンフルエンスまで増殖した時点で 37 °C/5% CO2 で 2 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定した。 次に、細胞を反応緩衝液とともに暗所、室温で30分間インキュベートした。 DAPI 染色後、細胞を Nikon Ti2 で画像化し、EdU 陽性細胞の数を視覚化しました。 陽性率はImage Pro Plus 6によって測定されました。

Comet アッセイは、COMET アッセイ キット (Enzo) を製造元の指示に従って使用し、以前の研究と同様に実行されました 59。 1 × 105/ml の細胞と溶融 LM アガロースを 1:10 (vol/vol) の比率で混合し、すぐに COMET スライドにピペットで移します。 スライドを暗所で4°Cで30分間平らに置き、次に4°Cで事前に冷却した溶解溶液に30分間浸しました。 スライドを取り外し、スライドから余分なバッファーをテープでそっと貼り付け、TBE バッファーで洗浄し、次に水平電気泳動チャンバーに移しました。 電圧（１Ｖ／ｃｍ）を１０分間印加した。 余分なＴＢＥを非常に丁寧にテープで取り除き、スライドを７０％エタノールに５分間浸し、サンプルを風乾した。 スライドをSYBR Greenで染色し、蛍光顕微鏡で分析しました。 COMET Assay Software Project (CASP ソフトウェア) を使用して、各サンプルで合計 70 ～ 150 個の細胞が評価されました。 尾部 DNA% = 尾部 DNA/(尾部 DNA + 頭部 DNA)、尾部モーメント = 尾部長 × 尾部 DNA%。

HR 修復活性アッセイは以前の研究と同様に実施されました 37。 簡単に言うと、pLKO.1およびshC11orf54 PLC/PRF/5細胞をpDR-GFPおよびpCBA-SceIでトランスフェクトした。 2日後、細胞を回収し、蛍光活性化フローサイトメトリー(FACS)によって分析して、GFP陽性細胞の割合を調べました。 ゲート戦略を補足図8に示します。

全RNAをpLKO.1およびshC11orf54 PLC/PRF/5細胞から抽出した。 次に、WuXiNextCODE Tec RNA-seq サービスによって RNA の配列が決定されました (n = 2)。 差次的発現遺伝子の重大な変化の GO 分析は、Metascape Web サイト (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)60 を使用して実行されました。 遺伝子セット濃縮分析では、以前に説明したように、GSEA v4.1.0 をさまざまな機能的特徴遺伝子シグネチャに適用しました 61,62。 GSEA は、濃縮されたシグネチャを識別するために、「Hallmark」または「KEGG」遺伝子セットを使用して実行されました。 FDR < 0.25 および公称 p 値 < 0.05 の遺伝子セットが有意であるとみなされました。

結果は平均値±標準偏差 (SD) として表されます。 統計的有意性のレベルは、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して p < 0.05 に設定されました。 *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。 すべての統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して実行されました。 サンプルと複製のサイズは図の凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された RNA-seq データは、アクセッション コード PRJNA939822、サンプル ID: SRR23648017、SRR23648018、SRR23648019 および SRR23648020 で Sequence Read Archive (SRA) データベースに保管されています。 未編集/未トリミングのウェスタンブロットゲルは補足図9に含まれています。論文のグラフの背後にあるソースデータは補足データ1に含まれています。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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pDR-GFP および pCBA-SceI プラスミドについて済南大学の Guo Chen 博士に感謝します。 この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2021YFA0804903)、中国国家自然科学財団 (助成金 32170772、32270810、81800833、および 81802189)、111 プロジェクト (B16021)、および自然科学財団によって財政的に支援されました。広東省 (助成金 2021A1515011227、2022A1515140040、2019A1515011847、および 2019A1515010591)。 QZ はまた、KC Wong Education Foundation の支援に感謝の意を表します。

これらの著者は同様に貢献しました: Junyang Tan、Wenjun Wang。

この作品は、Jianshuang Li、Qinghua Zhou の著者が共同で監修しました。

済南大学第六付属病院、済南大学、523573、東莞、広東省、中国

Junyang Tan、Wenjun Wang、Xinjie Liu、Jinhong Xu、Yaping Che、Yanyan Liu、Jiaqiao Hu、Liubing Hu、Jianshuang Li、Qinghua Zhou

済南大学健康科学センター（医学部）生物医学トランスレーショナル研究所、510632、広州、広東省、中国

Junyang Tan、Wenjun Wang、Xinjie Liu、Jinhong Xu、Yaping Che、Yanyan Liu、Jiaqiao Hu、Liubing Hu、Jianshuang Li、Qinghua Zhou

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このプロジェクトは JL と QZ によって監督され、実験は JL と QZ によって設計され、JT、WW、XL、JX、YC、YL、JH、および LH によって実行されました。 JT、WW、JL がデータを分析しました。 JT、WW、JL、QZ が原稿を執筆しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

Jianshuang Li または Qinghua Zhou との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Christina Karlsson Rosenthal。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Tan、J.、Wang、W.、Liu、X. 他。 C11orf54 は、CMA を介した HIF1A の分解をブロックすることで DNA 修復を促進します。 Commun Biol 6、606 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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受信日: 2022 年 9 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 19 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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