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Aug 31, 2023

ヒトへの制御されたGHB投与後のGHBおよびその新規アミノ酸およびカルニチン結合体の尿中濃度

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8983 (2023) この記事を引用

91 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ガンマ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) は、依然として臨床/法医学毒物学において課題のある薬剤です。 これは主に、内因性レベルまで急速に除去されることが原因です。 特に薬物によって促進された性的暴行の場合、サンプル収集はGHBの検出期間よりも遅く行われることがよくあります。 私たちは、ヒトへの制御されたGHB投与後の尿中の摂取/適用マーカーとしての適合性について、アミノ酸（AA）、脂肪酸、およびその有機酸代謝産物との新しいGHB複合体を調査することを目的としました。 LC-MS/MS を使用して、2 つの無作為化二重盲検プラセボ対照クロスオーバー研究 (GHB 50 mg/kg、参加者 79 人) で採取後約 4.5、8、11、および 28 時間のヒト尿サンプルの検証された定量化を行いました。摂取。 4.5時間の時点で、2つを除くすべての分析物について有意な差(プラセボ対GHB)が見つかりました。 GHB 投与から 11 時間後でも、GHB、GHB-AA、3,4-ジヒドロキシ酪酸、およびグリコール酸は依然として有意に高い濃度を示しました。 28時間ではGHB-グリシンのみ。 3 つの異なる識別戦略を評価しました: (a) GHB-グリシンのカットオフ濃度 (1 μg/mL)、(b) GHB-グリシン/GHB の代謝物比 (2.5)、および (c) 2 つの尿サンプル間の上昇閾値 ( > 5)。 感度はそれぞれ 0.1、0.3、または 0.5 でした。 GHB-グリシンのみが、主に 2 回目の被験者一致尿サンプルと比較した場合 (戦略 c)、GHB よりも長時間の検出を示しました。

短鎖脂肪酸であるガンマヒドロキシ酪酸 (GHB) は、乱用薬物 (DOA) として娯楽目的で消費されるだけでなく、薬物により助長された犯罪や犯罪で使用されるため、臨床毒物学および法医学毒物学において重要な分析対象物です。薬物促進性性暴行 (DFSA)1、2、3。 血液や尿などのマトリックスでは、GHB の検出時間はそれぞれ最大 6 時間および 12 時間までと短くなります4。 さらに悪いことに、GHB は内因性化合物でもある 5,6。そのため、GHB 摂取/投与後の低い外因性 GHB レベルを内因性レベルから区別することが特に困難になります。 内因性 GHB レベルと GHB 摂取量を区別するには、尿中のカットオフ値を 6 ～ 10 µg/mL とすることが一般的に推奨されています 1,5,7。 それでも、より長い間隔でGHBの検出と解釈を改善するには、追加のバイオマーカーが必要です。 GHB-グルクロニドとGHB-硫酸は広範囲に調査されました。 物議を醸す議論もありますが、ほとんどの研究では GHB-グルクロニドの検出に利点は見出されていません 8、9、10、11。 最近では、GHB の分解またはベータ酸化によって形成される有機酸が追加のバイオマーカーとして注目を集めています。 2,4-ジヒドロキシ酪酸 (2,4-DHB)、3,4-DHB、グリコール酸 (GA)、コハク酸 (SA)、およびスクシニルカルニチンの内因性濃度は、大規模なコホートで系統的に測定され 12、13、およびそれらの一般的な有用性が明らかになりました。 GHB の検出ウィンドウと解釈の改善が実証されました 14、15、16。 カルニチン、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、タウリン、フェニルアラニン）、ペントース、脂肪酸、リン脂質、およびいくつかのまだ知られていない特徴（U3、U4、U16）とGHBの新しい複合体（図1）も、有望な追加のGHBマーカーを示しています。 。 それらは、非標的代謝プロファイリング 17,18 または仮説に基づくアプローチ 19,20,21 のいずれかによって発見されました。 ただし、それらの尿中濃度に関する体系的な研究はまだ保留中です。 したがって、我々は、GHB、GHB-カルニチン、GHB-グリシン、GHB-グルタミン酸、GHB-タウリン、GHB-フェニルアラニン、GHB-脂肪酸エステル (C8-C18、C18:1) および有機酸 2 の尿中排泄を定量的に特徴付けることを目的としました。ヒトへのGHBの制御投与後の、4-DHB、3,4-DHB、GA、SA、スクシニルカルニチン、および3つの異なる識別戦略を適用してGHB摂取/適用の長期検出に対するそれらの有用性を評価する。

アミノ酸のグリシン、グルタミン酸、タウリン（左）、カルニチン、脂肪酸、またはペントース（右）と新たに同定されたGHB結合体の化学構造。

検証済みの液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 法 21 および尿中クレアチニンを使用して測定された各参加者の濃度を表 S1 に示します。 12C-同位体と13C-同位体の間で計算された濃度を比較すると、校正範囲内では良好な一致が示されましたが、高濃度では12Cの一致が劣ることが示されました（補足図S1）。 したがって、13C の結果は、キャリブレーションを超えるサンプル中の GHB 濃度の近似値として使用されました。 表 1 は、クレアチニン未調整/調整後の各条件で測定された濃度の概要 (平均、中央値、範囲) をそれぞれ示しています。 クレアチニン濃度は、治療、性別、疾患とは無関係であることが判明しましたが、予想される日内変動を示しました（研究II、11時間、補足図S2）。 GHB-カルニチンおよびGHB-アミノ酸複合体は、プラセボセッションとGHBセッションの両方で検出されました。 すべてのプラセボサンプルにおいて、GHB タウリン濃度のみが 0.05 μg/mL の定量限界 (LOQ) を下回っていました。 GHB 脂肪酸複合体は、どの治療条件でも検出されませんでした。 予想通り、測定されたすべての化合物の最高濃度は、GHB セッションで収集された最も初期の尿サンプルで観察されました。 以前の研究で発表された限られた数の本物の症例（ForTox pos 121、ForTox pos 215、それぞれ n = 7、表 1）と比較して、制御された投与（4.5 時間）後に測定された濃度は、GHB-カルニチンを除くすべての化合物で低かった。 未調整の濃度とクレアチニン調整後の濃度の間のスピアマン相関は高かった (r > 0.8)。 DHB異性体とGHB-グルクロニド（r 0.4〜0.6）、SA、スクシニルカルニチン（r 0.6〜0.7）のみが低い相関関係を示しました（補足図S3）。 コホート I と II の 4.5 時間サンプルを比較すると、研究コホート I で有意に高い濃度が測定された GHB-カルニチンを除いて、関連する差異は明らかになりませんでした。アミノ酸複合体濃度はコホート II でわずかに高かったです。 濃度は、年齢、性別、および基礎となるうつ病障害とは無関係でした。 どの時点でも女性ではSA濃度のみが有意に高く、4.5時間の時点ではうつ病患者では2,4-DHBのみが有意に高かった（補足図S4）。 GHBおよびGHB代謝物（プラセボ）の内因性濃度は、午後に著しく低い濃度を示したGHB-グルクロニドとスクシニルカルニチンを除いて、日中に依存しないことがわかりました（図3、補足図S5）。 図２Ａの代表例に示すように、研究コホートＩＩにおける代謝産物濃度とＧＨＢの濃度とのスピアマン相関は、４．５時間および１１時間では高く、２８時間では中程度であった。 対照的に、初期の尿濃度（4.5 時間）とそれぞれ 11 時間または 28 時間の尿濃度との間に相関関係がないことが示すように、初期濃度は後の時点の濃度に影響を与えませんでした（図 2B）。

(A) 尿中 GHB 濃度 (x 軸) と 4.5 時間 (明るい灰色)、11 時間 (濃い灰色)、および 28 時間 (黒色) での GHB-グリシンまたは 3,4-DHB 濃度の間の相関分析 (スピアマン、r) ）GHB摂取後、（B）4.5時間の濃度と11時間（濃い灰色）および28時間（黒色）の濃度間の相関。 実線は線形相関の結果を表します。

摂取後4.5、11、および28時間の研究コホートIIのプラセボおよびGHBセッションに由来する濃度は、図3および補足図S5に箱ひげ図として示されています。 各参加者の濃度は、GHB、GHB-グリシンおよびGHB-カルニチン、3,4-DHB、およびGAの代表例として示されています（補足図S6）。 プラセボ治療と GHB 治療の間の有意な差は、SA とスクシニルカルニチンを除くすべての分析物について、最も早い収集時点で観察されました。 GHB 投与から 11 時間後でも、GHB、GHB アミノ酸、3,4-DHB、および GA の濃度はプラセボよりも有意に高かった。 摂取後 28 時間では、GHB-グリシンのみが統計的識別を可能にしました。 GHB-ペントースおよび特徴 U4 は、外因性 GHB と内因性 GHB を区別する可能性を示しました。

研究 II で摂取後 4.5、11、および 28 時間で収集された、プラセボ (薄い灰色) および GHB 治療 (濃い灰色) の尿濃度のボックス プロット。 統計的比較は、片側ノンパラメトリック マン-ホイットニー検定を使用して実行されました (p < 0.05): *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。

プラセボ濃度に基づいてカットオフ値が選択され、投与後のさまざまな時点での GHB 摂取を検出するための感度がテストされました。 特異性、感度、PPV の結果を表 2 にまとめます。選択したカットオフを使用すると、GHB-グリシンは GHB (感度 0.4 対 0.1) または他のバイオマーカー (例: 3,4-DHB 感度 0.1) と比較して良好なパフォーマンスを示しました。少なくとも11時間まで。 ただし、28 時間後では、GHB-グリシンでも GHB の検出/内因性レベルとの識別が可能になったのは 9% の症例のみでした。

図 4 に代表的に GHB-グリシン、GHB-カルニチン、3,4-DHB、および GA で示されているように、代謝物比 (代謝物/GHB、MR) は GHB 後 4.5 時間から 28 時間まで増加しましたが、プラセボ治療では増加しませんでした。最も高い GHB GHB 投与の 4.5 時間後に濃度が観察され、プラセボと比較して MR が大幅に減少しました。 GHB-グリシン四分位範囲 (IQR) のみが、プラセボ条件下で観察されたものを上回りました。 プラセボ治療の最も高い IQR MR (2.5) を暫定的なカットオフとして採用すると、11 時間の時点で戦略 a) と比較して感度 (0.3) と特異度 (0.9) が低くなりました。 28 時間後には、同様の特異性を備えた感度 (0.3) が改善されました。

摂取後 4.5、11、および 28 時間の研究 II の尿サンプルから計算された、プラセボ (薄い灰色) および GHB 治療 (濃い灰色) の代謝物比 (分析物/GHB 濃度)。 点線は、すべての収集時点におけるプラセボ治療の四分位間の最高値と最低値を表します。

さらに、2 つの (被験者と時間が一致した) 尿サンプル間の分析対象物レベルの上昇 (> 5) の有用性を評価しました。 全体として、一般的なカットオフアプリケーションと比較して、より優れた感度が観察されました (戦略 a; 表 2)。 28 時間後、GHB 陽性症例の約 50% またはさらに 90% が、それぞれ GHB-グリシンまたは GHB-ペントースによって正しく分類されるでしょう。 ただし、一部の尿ペアでは、1 つのサンプルが対応するバイオマーカーに対して陰性であったため、GHB-グリシンについてはわずかに低い特異性が検出されました。

GHB 尿濃度の現在の解釈にはまだ改善が必要であり、新しいバイオマーカーを見つけるためにいくつかの研究が実施されました 8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、22、23。 我々は最近、異なるアミノ酸またはカルニチンを含む新しい尿中GHB複合体を提案しました（図1）17,18が、GHB摂取後のより長い期間にわたる定量的データは欠落しています。 今回の研究は、ヒトへのGHBの制御投与後のGHB、その結合体、および有機酸の定量値を初めて提供したものである。

2 つの研究コホート (79 人の参加者) からの尿サンプルが (再) 分析されました。 研究コホート II は最近の臨床試験 (-80 °C で約 6 か月保存) で構成されていましたが、研究コホート I は約 2 か月保存されました。 現在の研究で定量化する前に 8 年 (-80 °C)。 メソッド検証中の長期安定性は、-20 °C で最大 3 か月間テストされました。 アミノ酸結合体の濃度が減少する傾向が観察されましたが、GHB-カルニチンのみが大幅に減少しました21。 したがって、研究コホートIにおけるGHB摂取4.5時間後に採取された尿サンプル中のGHBアミノ酸結合体の平均および範囲は、コホートIIよりもわずかに低かった。 全体として、これらの発見は、少なくとも -80 °C で保存した場合、GHB アミノ酸複合体の十分な安定性を証明しています。 驚くべきことに、コホート I と II では GHB-カルニチンの濃度が著しく高いことがわかりました (表 1)。 しかし、GHB-カルニチンは抽出サンプル中でも不安定であることが判明しています。 この物質は吸湿性が高く、標準的な実験室条件下で取り扱うのが困難です。 サンプルの保管による解釈の問題を回避するために、長期間にわたる一致したサンプル収集を考慮して、一次データ評価を研究コホート II に焦点を当てました。

天然に存在する 13C 同位体は通常、全炭素原子の約 1.1% を占め、12C よりもはるかに低い MS シグナルを生成し、これによりダイナミック レンジが増加することが示されています 24,25。 メソッドの検証中に、13C 同位体を介して計算された GHB 濃度が以前の GHB メソッドの結果とよく一致することを示すことができました 21。 本研究の主な焦点は、新しいGHB代謝物、特に内因性レベルと外因性GHB摂取量との区別にあった。 したがって、我々は、13C の結果が校正範囲を超えるサンプル中の GHB 濃度の近似値として十分であると考え、さらなる希釈ステップを省略しました。

定量的な尿中濃度をクレアチニンレベルに調整する必要があるかどうかについては、批判的に議論されています26。 スポット尿サンプルでは、​​個々の希釈状態を考慮してクレアチニン調整が推奨されることがよくあります27。 臨床毒物学および法医学毒物学では、尿中クレアチニンは通常、妥当性パラメータとして決定されます 28,29 が、尿中薬物濃度の解釈では一般にクレアチニンレベルは考慮されません。 DHB 異性体を除いて、クレアチニン調整濃度と未調整濃度の間に強い相関関係が観察されました。 したがって、未調整濃度に関する結果と議論に焦点を当てました。

すべての個々の尿サンプルでではありませんが、すべての条件と収集時点で GHB 複合体が検出されました (表 1)。 年齢、性別、うつ病性障害は濃度に影響を与えませんでした。 すべての尿サンプルで脂肪酸エステルのみが検出されなかったが、これはおそらく脂肪酸エステルの高い親油性と、その結果として腎臓からの排泄が低下したためと考えられる。

内因性レベルを外因性適用の残基から区別するには、内因性レベルおよびその可能性のある日内/日内変動に関する知識が必要です。 スクシニルカルニチンのみに有意な変動が見られましたが、DHB 異性体と GHB グリシンでは、早朝のレベルが高くなるわずかな、有意ではない傾向が示されました。 全体として、プラセボサンプル中の GHB 有機酸濃度は、Kim et al.13 によって以前に発表されたものと同様の範囲にあり、Jarsiah et al.12 と比較して一般にわずかに低かった。新しい GHB 複合体については、最初のデータを提供する。 それでも、内因性レベルを確実に測定するには、GHB を適用していないさらに多くのサンプルを分析する必要があります。 将来の研究では、GHB-フェニルアラニンとGHB-タウリンのさらに低いLOQを目指すことも考えられます。

GHB 処理後、最も早いサンプリング時間で最高濃度が検出されました。 有機酸に関しては、この大規模なコホートからの我々の結果は、Kuetingらによる以前の発見と一致しています。 5人のナルコレプシー患者におけるGHB摂取後（体重1kg当たり22～34mg）16。 しかし、限られた数の本物の症例 (表 1、ForTox pos 121) と比較して、制御投与 (4.5 時間) 後に測定された濃度は、GHB-カルニチンを除くすべての化合物で低かった。 ジャルシアら。 らは、法医学的GHB事件におけるDHB異性体とGAについて同様の濃度を測定した(表1、ForTox pos 215)。 考えられる説明には、早期の尿採取またはより高い GHB 用量の摂取/投与が含まれます。 法医学事件では、薬物摂取と摂取量に関連するサンプリング時間はほとんどの場合不明です。 サンプルの保管と分析物の安定性も同様に重要です。 最近の 3 か月にわたる長期安定性実験では、GHB 陽性例では 2,4-DHB レベルと 3,4-DHB レベルの有意な増加が示されましたが、GHB 陰性例ではそうではありませんでした。 ただし、この効果は GA または GHB 複合体では示されませんでした 21。

GHB-カルニチン、SA、およびスクシニルカルニチンを除く GHB 代謝産物の濃度は、特に外因性適用によって得られた最高濃度で、GHB の濃度と高い相関を示しました。 後の時点 (28 時間) では、特に有機酸の場合、濃度が内因性起源である可能性が高いため、より弱い相関が観察されました (図 2)。 3,4-DHB では、外因性と内因性の起源の相関間の傾きが異なるようです。 GHB 摂取後のさまざまな時間における共役体または有機酸の濃度は、初期 GHB 濃度には依存しませんでした。 しかし、残念なことに、利用可能な時点は 3 つだけであり、除去率と基礎となる反応速度を計算することはできませんでした。 第二に、最初の尿サンプルは 4.5 時間後に採取されましたが、これは尿中に到達した最大濃度を必ずしも反映しているわけではありません。

したがって、入手可能な管理データに基づくと、GHB の用量が高くなると GHB 結合体の濃度が高くなる（ならない）ことを完全に排除することはできず、これは検出可能性の延長にも関連する可能性があります。

GHB の平均濃度は、摂取後 11 時間の時点ですでに推奨される GHB カットオフの 10 または 6 μg/mL を下回っており、これは GHB4 の既知の検出範囲と一致しています。 それにもかかわらず、濃度は依然としてプラセボ後よりも統計的に有意に高かった。 最初の探索的なバイオマーカー検索 17,18 では、GHB アミノ酸複合体は内因的に発生せず、外因性 GHB マーカーとして理想的な候補となるという期待が生じました。 しかし、本研究のより感度の高い分析検出法では、これらの結合体の内因性レベルが低いことも明らかになりました。 GHB-ペントースは、プラセボ尿サンプル中にかろうじて存在する唯一の分析物でしたが（<10％）、28時間後でもまだ検出可能でした（補足図S6）。 残念ながら、入手可能な参考資料はなく、このパラメータの方法の検証と定量化がなければ、結論は限られたままです。 同じことがまだ知られていない化合物 U4 にも当てはまります。 GHB 投与に明らかに関連しているため、さらなる研究には構造の解明が不可欠です 17。

プラセボ治療からの尿サンプルで検出された分析物ごとの最高の内因性濃度（100% の特異性に等しい）に基づいて、GHB 代謝物のカットオフ値を選択し、さまざまな時点での GHB 摂取を検出するための感度をテストしました。 さらに、本物のサンプルの濃度（表 1）が対照研究コホートの濃度を超えた場合、以前の出版物と同等または非常に類似した 2 番目のより高いカットオフが評価されました 15。 GHB-グリシン（暫定カットオフ 1 μg/mL）は、GHB の検出ウィンドウを約 28 時間まで延長できる最も有望なバイオマーカーとして際立っていますが、理想的には 1 に近い望ましい感度はまだ得られていません。 クエティングら。 は、GHB 摂取前の患者に一致する初期内因性濃度と比較して、GHB 摂取後の最大 22 時間の尿中クレアチニン調整濃度 2,4-DHB、3,4-DHB、および GA の上昇を報告しました16。 これらの発見は、私たちのデータセットでは確認できませんでした。 3,4-DHB のみが約 11 時間にわたって GHB 摂取量を正確に特定できましたが、依然として感度は低かった (14%)。 興味深いことに、同じ尿サンプル (H19、H20、H21、P21、および P25) では、他の参加者と比較して、特に 11 時間、場合によっては、GHB、GHB-グリシン、GHB-ペントース、および 3,4-DHB の濃度が高かった。 28時間後（補足図S6）。 これまでのところ、この所見は説明できていませんが、年齢、性別、併用薬、尿中クレアチニンとは無関係であることが示されています。

GHB を投与すると、内因性レベルと比較して GHB 尿濃度が数倍高くなります。 したがって、GHB 濃度に対する GHB 代謝物の MR を計算すると、最初はプラセボと比較して非常に低い MR が得られ、時間の経過とともに内因性比まで増加するかそれを超えます (図 4)。 GHB 代謝産物の排出が GHB よりも遅い場合、後の時点での対応する MR は、GHB を摂取しなかった場合の MR を超えるはずです。 評価したすべての MR のうち、GHB-グリシンのみが予想された傾向に従いましたが、中央値は依然としてプラセボの範囲内にありました。 プラセボ治療の最も高い IQR MR を暫定的な限界として選択すると、単一濃度のカットオフと比較してわずかに優れた結果が得られましたが、28 時間の尿サンプル中の GHB 摂取量を正確に検出するには依然として感度が低すぎました。

3 番目の識別アプローチとして、同じ個人からの 2 つの尿検体間の比率決定をテストし、個人の内因性レベルを説明しました。 日内の分析物の変動を避けるため、予備評価には時間を一致させたプラセボサンプルを使用しました。 この分析方法は、GHB 結合体のすべてのプラセボ サンプルで定量的な値を取得できるほど感度が高くありませんでした。 したがって、計算された濃度に基づく比率形成は、十分な場合には不可能でした。 代わりに、ピーク面積比 (分析物/内部標準 (IS)) を使用しました。これには、参照物質が必要ないという利点もあります。 このような標準は部分的に社内で合成されたものであり、まだ市販されていません 30。 プラセボ尿サンプルの存在量の差（4.5 時間対 28 時間）を外因性 GHB を含まないコホートとして使用し、最大上昇値 5 を示しました（GHB、GHB-グルタミン酸、GHB-フェニルアラニン、SA を除く）。 したがって、潜在的な上昇閾値として 5 が選択されました。 個々のサンプルで検出できない化合物には、ゼロ誤差による除算を回避するために、仮想ピーク面積/IS 比 0.00001 (本物のサンプルの最低値よりも 100 低い最小係数) が与えられました。 このアプローチでは、GHB 摂取の 28 時間後でも、はるかに高い感度が得られました。 サンプルの 1 つで分析物が検出されなかった (プラセボ) 尿ペアによって引き起こされる、より低い特異性値が観察されました。 このような状況下では、最初の尿サンプルのレベルがすでに非常に低いため、理論的には無限の上昇につながる可能性があります。 GHB-グリシンを例にとると、サンプルの 1 つで検出不可能な GHB-グリシンを含む 6 対を除去すると、特異性が再び 0.85 から 1 に増加しました。私たちの予備データは、2 番目の尿サンプルとの比較が GHB 検出を向上させる最良の戦略である可能性があることを示唆しています。 。 それでも、より多くのデータ、提案された標高閾値の確認、および重複した日常的な症例サンプルからの結果の評価が必要です。 したがって、最初のサンプルから 24 時間後 (時間を一致させて) 尿サンプルを収集することをお勧めします。

再分析されたサンプルは当初私たちの研究課題のために設計されていなかった研究からのものであるため、私たちの研究にはいくつかの制限がありました。 さらに、治療用（ナルコレプシー）GHB用量が投与されましたが、DFSA症例ではより高用量が一般的に使用されます。 最大 28 時間までの 3 つの収集時点のみが利用可能であり、適切な薬物動態分析 (例、排出率) が可能ではありませんでした。

私たちは、GHB の管理投与後のさまざまな GHB バイオマーカーに関する最初の包括的なデータを提供します。 GHB-AA コンジュゲートおよび 3,4-ジヒドロキシ酪酸は、追加の GHB 検出マーカーとして適していることが判明しました。 したがって、現在の GHB 分析は、GHB のみから他のいくつかのバイオマーカーまで拡張する必要があります。 ただし、GHB-グリシンのみが GHB よりも長時間の検出を示しました。 尿サンプルを、時間と被験者が一致した 2 回目の尿サンプルと比較したときに、最高の感度が得られました (戦略 c)。 それでも、DFSA犠牲者の2回目の尿サンプルを収集することが重要である可能性があり、最終評価の前に、このアプローチを使用して（より多くの）日常的なサンプルを分析する必要があります。

私たちは、スイスのチューリッヒで実施された 2 件の無作為化バランス二重盲検プラセボ対照クロスオーバー研究からの尿サンプルを使用しました。 これらは当初、健康な参加者におけるGHBの睡眠促進効果（研究I）と、健康な参加者および大うつ病性障害患者における記憶増強効果（研究II）を特徴付けるように設計されました。 チューリッヒ州倫理委員会とスイスメディックによって承認が得られました。 研究は ClinicalTrials.gov (それぞれ NCT02342366 および NCT04082806) に登録され、すべての研究プロトコルと方法は関連ガイドラインとヘルシンキの宣言に従っていました。 GHB (50 mg/kg 体重 Xyrem®) またはプラセボを 2 dL のオレンジ ジュースに溶解して投与しました。 セッション（プラセボとGHB）の間には、7日間の休薬期間が維持されました。 ヘルシンキの宣言によれば、参加者全員は潜在的なリスクについて説明され、書面によるインフォームドコンセントが提供されたという。

研究デザインについては、別の場所で詳しく説明されています31。 簡単に言うと、主な研究（n = 20人の健康な男性、平均年齢25.8±2.5歳、S01〜S20）では、早朝の尿サンプルが午前2時30分のGHB/プラセボ投与後、午前7時（4.5時間）に収集されました。実験の夜。 最初のパイロット研究では、GHB/プラセボが同じ方法で投与されましたが、実験の夜の午後 11 時に投与されました。 早朝の尿 (n = 20、SP01 ～ SP20) を午前 7 時に収集しました (8 時間)。 すべてのサンプルは、-80 °C で約 8 年間保管され、最大 2 回の凍結融解サイクルを受けました。 これらの尿サンプルは、以前の非標的メタボローム調査にすでに使用されていました 17,18。

研究コホート II は、健康なボランティア (H、n = 21、男性 6 名、女性 15 名、平均年齢 27 ± 6.6) および大うつ病性障害患者 (P、n = 19、男性 6 名) を対象とした最近の臨床薬物投与研究から得られました。 、女性13名、平均年齢27±6.9歳）。 実験の夜の早朝 (4.5 時間 ± 1 時間)、午後 (11 時間 ± 1 時間)、および翌朝 (28 時間 ± 1 時間) に収集された尿サンプルは、現在の GHB 定量実験に含まれました。 。 サンプルは分析まで約 6 か月間、-80 °C で保存され、最大 2 回の凍結融解サイクルを受けました。 当初の研究目的に対処するさらなる研究の詳細は、別の場所で公開される予定です。

使用した化学物質と溶媒、および検証された LC-MS/MS メソッドの詳細な説明は、参考文献 21 に記載されています。 本物の尿サンプル (100 μL) に 10 μL の IS 溶液 (GHB-d6 5 μg/mL、ブチリルカルニチン-d3 5 μg/mL) を添加しました。 すべてのサンプルを 500 µL アセトニトリルで希釈し、遠心分離し (14,000 rpm、15 分間)、上清をオートサンプラーバイアルに移しました。 分析は、Analyst ソフトウェア (バージョン 1.7.2) によって制御される Sciex 5500 QTtrap リニア イオン トラップ四重極 MS (Sciex、ダルムシュタット/ドイツ) に接続された Shimadzu LC-40Dx3 LC システム (島津、デュイスブルク/ドイツ) で実行されました。 簡単に説明すると、勾配溶出の後、SeQuant ZIC-HILIC カラム (Merck、ダルムシュタット/ドイツ) でクロマトグラフィー分離を実行しました。 流速は０．３５ｍＬ／分であった。 MS は、GHB および GHB-カルニチンの 13C 同位体を含む分析物ごとに 1 ～ 3 つの遷移を使用する、高度なスケジュールされた複数反応モニタリング モードで操作されました。 キャリブレーターは合成尿で調製されました。

クレアチニンは、Indiko Plus 装置 (Thermo Scientific、ブラウンシュヴァイク/ドイツ) の Jaffe 反応によって測定しました。

MultiQuant ソフトウェア (3.0.3、Sciex) をピークの統合と定量化に使用しました。 統計分析は、GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software、サンディエゴ/カリフォルニア州/米国) で実行されました。 グループ比較（プラセボ対GHB、摂取後の異なる時点）は、研究コホートIおよびIIにおいて、片側マン・ホイットニー検定またはクラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重補正検定によって実施されました（p < 0.05）。 性別と病気の影響は、Sidak の多重比較検定を使用した二元配置分散分析を使用して評価されました。 スピアマン相関分析を使用して、年齢を含む相関関係をテストしました。

研究コホート II における GHB 治療と内因性レベルを区別する能力について、さまざまな戦略が評価されました：（a）新しい GHB 代謝物のカットオフ濃度、（b）代謝比（MR、代謝物濃度 / GHB 濃度）、および（ c) 2 つの尿サンプル間のピーク面積比 (分析物/IS) の上昇。 GHB 治療後の尿サンプルを尿 1 として採取し、時間を一致させたプラセボ サンプルを尿 2 として採取しました。外因性 GHB を含まないデータセットは、4.5 時間 (尿 1) または 28 時間 (尿 2) で最も一致したプラセボ サンプルを通じて作成されました。 。 戦略の品質、真陽性 (TP)、偽陽性 (FP)、真陰性 (TN)、偽陰性 (FN) の数、結果として生じる感度 (TP/(TP + FN)、特異度 (TN/ TN + FP)、陽性的中率 (PPV = TP/(TP + FP)) を計算しました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、同僚のマヤ・ケラー氏の支援と議論に感謝し、研究目的でスイスのチューリッヒ大学法医学研究所に寄付した寛大な遺産に対してエマ・ルイーズ・ケスラー医学博士に感謝の意を表したいと思います。 研究 II は、ES に与えられたスイス国立財団 (SNF Nr. 175780) からのプロジェクト助成金によって財政的に支援されました。

法医学薬理学および毒物学部門、チューリッヒ法医学研究所、チューリッヒ大学、Winterthurerstrasse 190/52、8057、チューリッヒ、スイス

アンドレア・E・シュトイアー、ダリオ・A・ドルンビアラー、トーマス・クレーマー

精神科、精神療法、心身医学科、チューリッヒ精神科大学病院、チューリッヒ大学、8032、チューリッヒ、スイス

フランチェスコ・バヴァト、ローラ・K・シュナイダー、ダリオ・A・ドルンビアラー、オリバー・G・ボッシュ、ボリス・B・クエドナウ、エーリッヒ・ザイフリッツ

チューリッヒ神経科学センター、チューリッヒ大学およびスイス連邦工科大学チューリッヒ校、8057、チューリッヒ、スイス

ボリス・B・クエドナウ & エーリッヒ・ザイフリッツ

スイス連邦工科大学チューリッヒ薬学研究所、8093、チューリッヒ、スイス

クリスチャン・シュトイアー

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FB、LKS、DAD、OGB、BBQ、ES は臨床研究とサンプル収集を概念化しました。 AES と TK は分析セットアップと評価を設計しました。 AES はデータの分析と評価を実行しました。 AES が原稿を起草した。 TK、FB、BBQ が原稿を修正しました。 著者全員が原稿をレビューし、最終版を承認しました。

アンドレア・E・シュトイアー氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Steuer、AE、Bavato、F.、Schnider、LK 他。 ヒトへの制御されたGHB投与後のGHBおよびその新規アミノ酸およびカルニチン結合体の尿中濃度。 Sci Rep 13、8983 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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受信日: 2023 年 1 月 17 日

受理日: 2023 年 5 月 31 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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