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Jul 17, 2023

CLE33ペプチドはシロイヌナズナの自己分泌および傍分泌シグナル伝達を介して師部分化を抑制する

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 588 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

植物の分裂組織は、分裂中の分裂組織細胞への光同化物とホルモンの一定の供給を必要とします。 成長する根では、そのような供給は原始部のふるい要素によって届けられます。 原師部は根尖分裂組織に対する優れた機能により、最初に分化する組織です。 このプロセスは、一方では正の制御因子である DOF 転写因子である OCTOPUS (OPS) と BREVIX RADIX (BRX)、もう一方では負の制御因子である CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION RELATED (CLE) ペプチドとそのペプチドが関与する遺伝回路によって制御されています。同族受容体 BARELY ANY MERISTEM (BAM) 受容体様キナーゼ。 brx および ops 変異体は、BAM3 の変異によって完全に回復できる不連続な原師部を保有していますが、既知の 3 つの師部特異的 CLE 遺伝子である CLE25/26/45 が同時に変異した場合には部分的にしか回復しません。 今回我々は、CLE45 と密接に関連する CLE 遺伝子、CLE33 を特定しました。 我々は、二重変異体 cle33cle45 が brx および ops 原師部表現型を完全に抑制することを示します。 CLE33オルソログは基底被子植物、単子葉植物、および真正双子葉植物に見られ、シロイヌナズナおよび他のアブラナ科でCLE45を生じさせる遺伝子重複は最近の出来事であると思われる。 こうして私たちは、原師部形成に必須の役割を果たすこれまで未確認のシロイヌナズナCLE遺伝子を発見しました。

維管束植物では、師部組織が糖とシグナル伝達分子を輸送して、成長と貯蔵のために器官を沈めます1,2。 成長中のシロイヌナズナの根では、根の頂端分裂組織は大きなシンクであり、機能的なふるい要素を含む 2 つの師部極が分裂組織領域に師部樹液を降ろします 3。 各極は、外側から 2 つの師部極周環セルと内側から 1 つの後師部篩要素に隣接する原師部篩要素、およびこれらの篩要素セルに隣接する 2 つの随伴セルから構成されます。 この複雑な構造は機能単位として機能します4。 注目すべきことに、根分裂組織への糖とホルモンの送達は、原師部篩要素によって独自に媒介されるのに対し、後師部篩要素は根のこの領域では未分化のままである5。

原師部のふるい要素の形成プロセスには、細胞壁の強化、除核、ふるい板の形成など、根本的な細胞の修飾が必要です6、7。 シロイヌナズナにおける原師部発生の遺伝的制御は、師部極全体の正確なトランスクリプトーム解析 4 やふるい要素の発達 6 など、過去 10 年間に集中的に研究されてきました 4、6、8、9、10、11。 原師部の分化は、ホルモン勾配、DOF 転写因子、SMXL 転写抑制因子などの複数の制御因子によって制御されます 9,12。 さらに、2 つの膜局在タンパク質、BREVIS RADIX (BRX) および OCTOPUS (OPS) は、原師部発生の正の制御因子として機能します 8,10。 brx および ops 機能喪失変異体は、分化できないいわゆるギャップ細胞を特徴とする不連続な原師部を示します。 原師部の連続性が中断されると、根の頂端分裂組織への師部液の送達が減少し、根の成長が制限されます8,10。 brx サプレッサー スクリーニングでは、ほとんどのメリステム 3 (BAM3) が同定され、bam3 は brx と ops10 の根の成長とギャップ細胞の表現型の両方を回復しました。 BAM3 は、CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION 45 (CLE45) ペプチドの同族受容体であるロイシンリッチリピート受容体キナーゼ (LRR-RLK) をコードします13。 最近、師部で発現する CLE 遺伝子の高次変異体 (CLE25/26/45) が brx および ops ギャップ細胞の表現型を部分的にレスキューすることが示されましたが、このレスキューは bam314 で達成された完全なレスキューのレベルには達していません。 受容体とそのリガンド間のこの表現型の不一致は、追加の内因性 CLE ペプチドである BAM3 リガンドがまだ同定されていないことを示唆しています。

CLE ペプチドは、N 末端にアポプラスト放出のためのシグナルペプチド、中央可変領域、および切断された C 末端に保存された 12 ～ 13 残基の CLE ドメインを持つ、約 100 アミノ酸のプレプロペプチドから生成されます。成熟CLEペプチドを放出するためにオフになります。 遺伝子サイズが小さく、CLE ドメイン外の配列の多様性が高いことを考慮すると、CLE 遺伝子のゲノム注釈付けは困難な場合があります。 シロイヌナズナでは、彼らの発見は最初、CLV317 のクローニング後の変異体スクリーニングから得られました 15,16。 シロイヌナズナゲノムの最初のリリース 18 により、数回の繰り返しで CLE ファミリーの追加メンバーの同定が可能になりました 19、20、21、22、23。 現在までに、27 の固有のペプチドをコードする 32 の CLE 遺伝子に注釈が付けられています。 私たちは最近、トマトの CLE 遺伝子ファミリーを調査し、37 個の新しい CLE 遺伝子を発見しました 24 。これにより、シロイヌナズナでさらに CLE 遺伝子が発見されていないのかどうかという疑問が生じました。

今回我々は、これまでのゲノム解析では見逃されていたシロイヌナズナCLE33遺伝子の同定を発表する。 我々は、この遺伝子が発生中の根師部で発現し、原師部細胞系譜および隣接細胞における原師部分化の阻害においてBAM3受容体を介してCLE45と重複して作用する活性ペプチドをコードしていることを示す。

追加のシロイヌナズナ CLE 遺伝子を検索するために、既知のシロイヌナズナ由来の 32 個の完全長 CLE タンパク質をクエリとして使用して、非厳密な t-BLAST-n 分析を実行しました。 我々は、第 1 染色体の注釈のない領域で、機能的シグナルペプチドの存在を含む CLE 遺伝子のすべての特徴を示す 1 つの配列を発見しました。 他のアブラナ科の種では、この遺伝子座は保存されており、CLE45様ホモログとして注釈が付けられています（補足図1a）。 シロイヌナズナでは、この遺伝子座が転写され、CLE33と名付けた遺伝子の発現が確認されました（図1bおよび補足図1b）。 その全長タンパク質配列に基づいて、我々は、CLE33が、十分に特徴付けられている師部発現CLE45の最も近い相同体であることを決定した（図1a）10、11、13。

シロイヌナズナの全長 CLE プレプロペプチドの系統樹。 青い線は、根師部組織で発現したクラスターを示します。 b Araport11 RNA-seq に基づく、JBrowse で可視化した光照射下で生育した実生のマッピング範囲からの転写の証拠。 予測される CLE33 コード配列の相対位置を図式的に示します: シグナルペプチドは緑色、CLE ドメインは青色です。 c 根の原師部組織におけるCLE33、CLE45およびCLE26のプロモーター活性を示す転写融合。 スケールバー = 50 μm。

CLE33の発現パターンについての洞察を得るために、GUSレポーターを駆動するためにそのプロモーター領域をクローン化しました（補足図1c）。 CLE33 発現は、根分裂組織、ロゼット接合部および葉、子葉、および花序茎の血管系と特に関連していました。 発現組織を正確に決定するために、同じプロモーターと2つの追加の師部特異的CLE（CLE26およびCLE45）を使用して、核蛍光タンパク質NLS-シトリンの発現を駆動します（図1cおよび補足図1d）。 根分裂組織では、3 つすべてが原師部組織で特異的に発現されますが、発現の開始にはわずかな違いがあります。 CLE45 の発現は、ふるい要素前形成層前駆体の最初の周斜細胞分裂の直後、ふるい要素前駆体細胞の初期に観察できます。 CLE33 の発現は、発生中の原師部篩要素細胞の数細胞後に始まり、CLE45 の発現ドメインと大部分が重複します。 以前に発表されたレポーター 25、26 によれば、CLE26 は、細胞壁の肥厚が起こるふるい要素分化の後期段階で活性を示します。

ほとんどの CLE ペプチドは、過剰発現した場合、またはナノモル濃度で成長培地に添加された場合に根の成長停止を誘導するため、根活性型と呼ばれます 13,26。 CLE33 ペプチドが一次根の成長も阻害できるかどうか、また根分裂組織でのこのペプチドの認識にどの受容体が関与しているかを確認するために、CLE33 ペプチドを成長培地に 0 ～ 300 nM の濃度で添加し、培地中での根の成長阻害効果を評価しました。野生型および機能喪失型CLE受容体変異体（図2a）。 野生型では、根の成長は 3 nM の CLE33 で阻害され、濃度が高くなるほど顕著になります。 他の既知の根活性型 CLE と同様に、この応答は最高濃度であっても完全に CLV2/CORYNE 依存性でした 13。 対照的に、bam 変異体はさまざまな応答を示しました。 bam2-4 は野生型に対して同様の感受性を示しましたが、bam1-3 は CLE33p に対して高感受性でした。 この約3倍の過敏性は、CLE26およびCLE45ペプチド（補足図2a、b）、および独立したbam1-4対立遺伝子のCLE33ペプチド（補足図2d）でも観察されました。 一方、bam3変異体は100nMのCLE33ペプチドまでは反応せず、300nMという非常に高濃度でのみ応答を示しました（図2aおよび補足図2c）。 BAM1 の機能喪失と組み合わせた場合にのみ完全な非感受性が達成され、BAM1 が高濃度の合成 CLE33 ペプチドに対する根の成長応答を媒介する役割を果たしていることが示唆されました。 この発見をより近い生理学的条件下でさらにテストするために、XVE-エストラジオール誘導システムを使用してCLE33を異所的に発現させました（補足図3）。 野生型はCLE33の異所性誘導に強く反応しましたが、bam3-2株はエストラジオール濃度が高くても非感受性のままでした。 これらの結果は、合成および内因性 CLE33 ペプチドが根の成長阻害効果のために BAM3 を必要とすることを示唆しています。

a 野生型およびCLE受容体変異体におけるCLE33pによる用量依存的な根の成長阻害。 b 合成 CLE33 (30 nM)、CLE45 (30 nM)、CLE26 (3 nM) ペプチドによる根の成長阻害。 c CLE33ペプチド変異体CLE33M2K、CLE33G4P、CLE33S7P（30nM）の根の成長阻害。 a ～ c​​ の文字は、異なる統計グループ (ANOVA、事後テューキー検定) を示します。

BAM3 は CLE45 ペプチドの同族受容体であることが示されており 13、bam3 変異体は CLE33 および CLE45 ペプチドに対して同様の非感受性を示します（図 2b および補足図 2a）。 このユニークなBAM3依存性は、CLE33およびCLE45ペプチドに非常に特異的ですが、密接に関連するCLE26ペプチドには特異的ではありません（補足図2b）。 これら 3 つのペプチドのアミノ酸配列を比較することにより、4 位と 7 位の保存されたプロリンが、CLE33 ではグリシンとセリンに、CLE45 ではアルギニンとセリンに置き換えられていることがわかりました（図 2b）。 受容体特異性におけるこれらのアミノ酸の重要性をさらに調査するために、これら 2 つのペプチド間の残基を交換することによって CLE26 および CLE33 の変異体を作成し、テストしました。 まず、すべてのペプチド変異体 (CLE26P4G、CLE26P7S、CLE26P4G/P7S、CLE33M2K、CLE33G4P、CLE33S7P) は野生型では強力な根の成長阻害効果があるが、crn-10 変異体ではほとんど効果がないことを観察しました。これは、アミノ酸が置換は根の成長を抑制する能力に影響を与えませんでした（図2cおよび補足図4）。 しかし、BAM3依存性は4位と7位の残基に強く依存していました。CLE33の4位または7位にプロリンが存在するとBAM3独立応答が生じ（図2c）、逆に両方のプロリンを置換する必要がありました。 CLE26では、bam3変異体の根の成長を阻害しません（補足図4）。 総合すると、これらの結果は、4 位と 7 位にプロリンが存在しないことが、CLE33 ペプチドと CLE45 ペプチドの BAM3 認識特異性を決定することを示唆しています。

根の原師部の発達は、成長培地に添加された根活性 CLE ペプチドによって抑制されることが以前に示されています 13。 原師部の同一性に対するCLE33の効果をテストするために、CLE33ペプチドの一晩処理時の原師部マーカーpCVP2:NLS-3xVenusの発現を評価しました（補足図5）。 原師部の同一性に対する CLE33 の阻害効果は、CLE26 および CLE45 の効果と同様であり、CLE33 が原師部分化の負の制御因子として作用することを示唆しています。

植物におけるCLE33の生物学的機能およびCLE45との遺伝的関係を理解するために、野生型およびcle45-2バックグラウンドでCRISPR-Cas9媒介ノックアウト変異体を作成しました（補足図6）。 bam3¸と同様に、単一のcle33および二重cle33cle45変異体は、私たちの条件では再現可能な根の成長のマクロ表現型を示しません（図3および補足図7）。 以前の報告によれば、BAM3 機能喪失変異体は、brx および ops8,10 の不連続な原師部分化を完全にレスキューすることができますが、cle4514 には当てはまりません。 我々は、この表現型の不一致が原師部組織に残っている CLE33 の存在に起因する可能性があるかどうかを尋ねました。 これをさらに調査するために、二重変異体 cle33-3 cle45-2 と brx-3 および ops-2 を交配しました。 CLE33単独の変異は、根の成長とbrx-3およびops-2の原師部の連続性の回復にまったく影響を与えないか、またはほとんど影響を与えませんでした（図3および補足図7）。 我々は、cle45 が根の成長表現型を部分的に抑制したが、原師部ギャップ細胞の頻度を大幅に減少させることができなかった、以前に発表された結果を再現することができました 14。 cle33 と cle45 の組み合わせは、根の成長と原師部の不連続表現型を完全にレスキューする可能性があり、CLE33 と CLE45 がこの遺伝回路で重複して作用することを強く示唆しています（図3および補足図7）。 これらの結果を総合すると、原師部の分化における CLE33 の負の役割が裏付けられます。

a 発芽後10日目の根の長さ。 文字は異なる統計グループ (ANOVA、事後テューキー検定) を示します。 b カルコフルオルホワイトで染色された根の代表的な共焦点画像。 赤い矢印は原師部ギャップ細胞を示します。 スケールバーは 100 μm に相当します。 c ギャップセル周波数の定量化。 文字は統計グループを示します (Benjamini-Hochberg 補正を使用した χ2 検定)。

BRX または OPS の機能喪失によって引き起こされる原師部の発育不全は、高用量の受容体 BAM3 または師部特異的 CLE リガンドによって説明できる可能性があります。 この可能性をテストするために、我々は brx および ops 根組織における転写物の蓄積を定量化しました。 我々は、転写レベルではBAM3がアップレギュレートされておらず、CLE25、CLE26、およびCLE45でも発現の大幅な減少を示したことを発見しました（補足図8a）。これは、brxおよびopsにおけるBAM3 / CLE33 / 45媒介シグナル伝達の増加を示唆しています突然変異は別のメカニズムによって引き起こされます。

原師部の連続性を分析しているときに、主要な原師部ふるい要素細胞ファイルに隣接する隣接細胞に由来する異所性ふるい要素様細胞の追加の表現型を発見しました。 これらの細胞ファイルは、細胞壁の肥厚など、発達中のふるい要素の特徴を示しています（図4a）。 最近、師部 CLE の複数の機能喪失変異体、BAM 受容体、および CIK 共受容体変異体で関連する表現型が示され、CLE シグナル伝達が隣接する細胞のふるい要素への分化を制限していることが実証されました 9。 この以前の分析は、原師部ふるい要素と後師部ふるい要素の両方が分化して厚い細胞壁を有する師部発生の後期段階で行われました9。 私たちの分析では、分裂組織ゾーンに焦点を当てました。 我々は、変異体における異所性原師部分化事象の頻度を定量化しました。 BAM3の非存在下、および三重変異体cle33 cle45 brxおよびcle33 cle45 opsでは異所性分化の増加が見られましたが、二重変異体の組み合わせでは増加しませんでした（図4bおよび補足図8b）。 この違いは、異所性ふるい要素の形成を抑制することが知られているこれらの背景（補足図8a）におけるbrxおよびopsの不在下での師部の同一性の低下、および/またはCLE25 / CLE26のレベルの低下による可能性があります9。 それにもかかわらず、私たちの分析の結果は、CLE33とCLE45が異所性原師部ふるい要素の形成の阻害において重複して作用することを示しています（図4cおよび補足図7）。

a カルコフルオルホワイトに染色された根の共焦点画像。 青い矢印は細胞壁の強化を示す細胞ファイルを示し、原師部の分化プロセスを受けていることを示しています。 スケールバーは50μmに相当します。 b 根における異所性原師部分化の頻度。 文字は統計グループを示します (Benjamini-Hochberg 補正を使用した χ2 検定)。 c BAM3受容体を介したCLE33/45ペプチドによって媒介される自己分泌および傍分泌シグナル伝達の概略モデル。

最近、CLE25、CLE26、および CLE45 はプロモーター領域に DOF 転写因子結合部位を持ち、DOF2.29 によって誘導されることが証明されました。 CLE33プロモーター領域の分析により、DOF2.2、DOF2.4 / PEAR1、DOF3.2、OBP3、DOF5.1 / PEAR2、およびDOF5.6の同様の結合部位が明らかになりました（補足図8c）。 この結果は、CLE33 が DOF-CLE 遺伝回路において重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

2 つのペプチドをコードする遺伝子、CLE33 および CLE45 は機能的に重複しているようで (図 3 および 4)、高い配列および発現パターンの類似性を共有しています (図 1)。 したがって、それらは遺伝子重複イベントの結果である可能性があります。 それらの進化の起源を知るために、私たちは多様な維管束植物種にわたって系統解析を実行しました。 私たちは、基底被子植物、単子葉植物、真正双子葉植物のゲノムでCLE33オルソログを特定しましたが、裸子植物のゲノムでは特定せず、これが約2億年前に出現したことを示唆しています（補足図9a）。 興味深いことに、明確な CLE45 オルソログはアブラナ目種でのみ見つかりました。 多重配列アラインメントにより、アブラナ目CLE45はシグナルペプチドの直後のN末端部分に他のCLE33/45様タンパク質と相同性のない拡張可変領域を有することが明らかになった（補足図9b）。 ただし、CLEドメインを特に分析すると、CLE45が祖先CLE33オルソログにより類似していることが観察されました（補足図9c）。 このような発生の可能性の 1 つは、初期のアブラナ目での重複の後、1 つのコピーがその可変領域内で遺伝的に急速に移動し、現在の CLE45 が生じたということです。 このようなシナリオでは、アブラナ目 CLE33 は、CLE ドメインの残基 2/3/4 を除いて、祖先配列の大部分を維持していました。 驚くべきことに、CLE33とCLE45の両方のすべてのオルソログは4位と7位にプロリンを持たず、これがシロイヌナズナの受容体知覚特異性に影響を与えることが判明しました（図2）。

さらに、これら 2 つのリガンドを認識する受容体をコードする遺伝子である BAM3 の進化的起源を調査しました。 裸子植物まで存在するオルソログが見つかりました（補足図10）。 被子植物における初期の重複により、BAM3 と BAM4 の 2 つのコピーが生成されました。 BAM3 はすべての被子植物グループに見られますが、BAM4 は特異なことにアブラナ科種のゲノムには存在しません。 BAM4 の喪失は、アブラナ目での CLE45 の出現と同時に発生します。 しかし、BAM4 リガンドとその機能は依然として不明です。 私たちの発見は、これらの受容体とリガンドのペア、および植物の進化を通じてそれらの潜在的に保存された機能をさらに探求するための新たな方向性を開きます。

近年、さらに多くのペプチドリガンドをコードする遺伝子がシロイヌナズナおよび他の植物種で発見されている24、27、28、29、30、31。 これらは、ストレス誘発性CTNIP/SCREWペプチド27、28などのこれまで知られていなかったファミリー、または本研究におけるCIF/TWS131やCLEなどのよく特徴付けられた遺伝子ファミリーに属します。 シロイヌナズナを含む植物ゲノムの注釈では、そのようなペプチドをコードする遺伝子の多くが依然として抜け落ちているようです。 しかし、トランスクリプトミクスやペプチドミクスと組み合わせたリボソームプロファイリングなどの高度な手法 32,33 は、Medicago32 やトウモロコシ 33 における数千のそのような遺伝子の同定に大きな成功を収めています。 さらに、隠れマルコフモデル 34 を使用したゲノム全体の分析により、新しいペプチドの同定につながりました 24,35。 このような先進的な方法の助けを借りて、無数の発生および適応反応を調節する植物シグナル伝達ペプチドの完全なレパートリーを間もなく取得できるようになるでしょう。

私たちの研究では、CLE 遺伝子に対して非厳密な t-BLAST-n 検索を実行したため、以前にアノテーションが付けられていない CLE33 を特定することができました。 4 位と 7 位のプロリンは CLE ペプチドで最も保存されているアミノ酸の 1 つであり、CLE33/45 にはプロリンが存在しないため例外となり、これらの遺伝子が後に同定された理由の一部が説明されます 22。 構造の観点から見ると、プロリン残基はその不規則な幾何学的形状により、独特の構造変化をもたらします 36。 プロリンの側鎖はペプチド骨格に 2 回結合し、独自の二次構造を形成します。 CLE受容体および共受容体結合表面との相互作用に対するプロリンの寄与についてはほとんど知られていない。 しかし、成熟 CLE ペプチドでは、プロリン 4 および 7 がヒドロキシル化され、いずれかまたは両方がアラビノースの 3、4、または 6 残基でグリコシル化されることが示されています 37。 CLE40 ペプチドの 4 位のヒドロキシプロリンは、前駆体ペプチドの誤切断を防ぐことが示されました 38。 同時に、成熟 CLE40 ペプチドにおけるヒドロキシル化の有無および 4 位のプロリンのアラニンへの置換 (P4A) は、根の成長アッセイにおけるペプチドの生物活性に影響を与えませんでした 38。 さらに、CLE9 の 4 位と 7 位のヒドロキシプロリンをプロリンで置換しても、インビトロでの BAM1 への結合親和性に影響はありませんでした 39。これは、プロリン 4 自体とプロリンの水酸化がペプチドと受容体の相互作用に必須ではないことを示唆している可能性があります 38,39。 しかし、修飾された CLE26 および CLE33 ペプチドを用いた我々の生物活性アッセイでは、4 位と 7 位のプロリンが受容体特異性の決定因子であることが示されています。 BAM3 では、Q226Y228Y231 残基が CLE45 結合に重要であることが証明されていますが 13、プロリン 4 および 7 の欠如が BAM3 との特異的結合にどのように寄与するかについてはさらなる解明が必要です。

高度に特殊化された糖を伝導するふるい要素の出現は、陸上植物の進化における重要なステップでした。 この発明により、光を奪い合って太陽に向かって成長する必要がある光合成器官と、土壌深くに成長する吸水器官の分離が容易になりました。 原始的なふるい要素ファイルは褐藻類やコケに見られ40、部分的なプロトプラストの分解と除核のみを示すことがよくあります。 裸子植物を含むすべての非開花維管束植物は、端壁と側壁の両方にふるい領域を持ち、ふるい板を持たないふるい細胞を持っています41。 裸子植物では、導電性のふるい細胞には隣接する伴細胞がなく、細長い紡錘状の構造のような形をしており、ふるいの細孔が狭いふるい領域によって軸方向と横方向に接続されているため、流動抵抗が大きくなり、輸送速度が遅くなります。 被子植物は、端壁にふるい板を備えた高効率の孤立した師部ふるい要素を発達させ、これにより光同化物の高速輸送が促進されます 41,42。 今回我々は、根の原師部形成における新しい分子プレーヤーである低分子シグナル伝達ペプチド遺伝子 CLE33 を同定した。 シロイヌナズナの根では、師部特異的 DOF 転写因子が師部発達の一連の正の制御因子と、フィードバック ループで DOF 発現を下方制御する CLE を誘導します 9,12。 上流の調節配列に DOF 結合部位があるため、CLE33 はこの遺伝回路に関与している可能性があります。 我々は、CLE33がCLE45と協調して作用し、BRX/OPSによって媒介されるふるい要素の分化に対抗することを実証した。 このようなメカニズムは、内因性の合図や環境条件に応じてふるい要素の分化の適切なタイミングを定義する役割を潜在的に持つ可能性があります。 さらに、CLE33がCLE45と重複して作用して、原師部に隣接する細胞がふるい要素に分化するのを抑制することを示します。 これらの結果は、CLE33/45が自己分泌シグナルと傍分泌シグナルの両方として作用するのに対し、師部の他の2つのCLE遺伝子（CLE25およびCLE26）は、原師部の分化を調節するBRX/OPS-BAM3モジュールにおける自己分泌シグナルとしての役割が限定的であることを示唆している。 この経路のもう 1 つの役割である RECEPTOR PROTEIN LIKE KINASE 2 (RPK2) が原師部の分化に関与していることが最近示されました 43。 機能喪失型 rpk2 変異体は、brx、ops、または cvp2cvl1 変異体の原師部ギャップ表現型と根の成長を部分的にレスキューすることができました 43。 RPK2 が BAM1 と遺伝的に相互作用し、2 つのタンパク質がヘテロマー複合体を形成することが示されていますが 44、RPK2 と BAM3 の相互作用の可能性はまだ調査されていません。

細胞を取り囲む原師部のふるい要素がふるい要素細胞に発達する能力は、この組織の発達の可塑性にとって重要です43。 発生中の原師部のレーザーアブレーションは、隣接する細胞の分化を引き起こし 43、元の中断された原師部を迂回して、分裂組織への糖とホルモンの供給を維持します。 原始部の機能には、分化の可能性を抑制することと、失敗した場合にふるい分け要素を維持することの間の適切なバランスが不可欠であると思われます。 なぜ 1 つの単一機能ふるい要素ファイルのみを維持することがこれほど厳密な遺伝的制御を必要とするのかについては、まだ解明されていません。

高等維管束植物では、CLAVATA 経路は、CLE ペプチド遺伝子の数だけでなく、CLV1/BAM 様 RLK の重複や受容体様タンパク質 CLAVATA2 と受容体様タンパク質の出現などの受容体複合体の新しい構成要素の両方によって大きく拡張されました。疑似キナーゼ CORYNE45。 基底被子植物で見つかったCLE33オルソログの場合、植物の進化中に、師部で発現したCLEが動員されて、光同化物の高速移動で効率的に機能する独特の被子植物師部組織を形成した可能性がある。

EnsemblPlant データベース内の A. thaliana ゲノムにおける t-BLAST-n 検索は、A. thaliana からの既知の 32 個の完全長 CLE タンパク質をクエリとして使用して実行されました。 より多くのヒットを取得するために、e 値のしきい値は元の設定 10-1 ではなく 10 に設定されました。 CLE 遺伝子として注釈が付けられていない候補配列は手動でクエリと比較されました。 CLE ドメインに類似した配列のみを、シグナルペプチドの存在、発現の証拠、および記載されている別のタンパク質の一部ではないかどうかについてさらに分析しました。 フィルタリング後、染色体 1 の注釈のない領域にある 1 つの単一配列が残り、CLE 遺伝子のすべての特徴を備えていました: CLE33。

この研究で記載されたすべての変異体は、シロイヌナズナ コロンビア-0 (Col-0) バックグラウンドにあります: clv2-113 crn-1013、bam1-3 (SALK_015302)、bam1-4 (SALK_107290)、bam2-4 (SAIL_1053_E09)、bam3 -2 (SALK_044433)13、bam3-3 (SALK_118860)、bam1-4 bam3-3、bam2-4 bam3-2、cle45-246、brx-347、ops-2 (SALK_139316)8。

CLE33 の機能喪失変異体は、CRISPR-Cas9 塩基遺伝子編集によって生成されました。 オフターゲットの少ないガイド RNA の設計は、CCTop (10.1371/journal.pone.0124633) を使用して実行されました。 gRNA の生成は、プライマーダイマーアニーリング (C67xC68; C69xC70) によって達成され、BsaI カットライゲーションによって目的のベクター pAGM5526148 にクローニングされました。 A. thaliana Col-0 野生型および cle45-2 を、Agrobacterium tumefaciens 懸濁液中での花の浸漬によって形質転換しました。 トランスジェニック種子をDsRed蛍光についてスクリーニングした。 CLE33 のフレームシフトを生成する変異を、非トランスジェニック子孫で検索しました。 高次の変異体は交配によって得られた。

遺伝子およびプロモーター領域は、補足表 1 に示されているプラ​​イマーを使用した Phusion PCR によって増幅されました。プラスミドは、Golden Gate モジュラーアセンブリによって補足表 2 に示されているように構築されました 49。

CLE33/CLE45 および BAM3 ホモログは、Phytozome13 および PLAZA 裸子植物データベースで BLASTP によって検索されました。 カリカパパイヤではヒントが見つからなかったため、t-BLAST-n を実行して CLE33/45 ホモログを見つけました。 トマトの CLE 配列は 24 から取得されました。 全長タンパク質配列は、図1aについてはMUSCLEを使用してMEGA-X50で手動でキュレートするか、補足図についてはDASHを有効にしたMAFFT51を使用してアラインメントしました。 S9とS10。 このアライメントを使用して、IQTREE52 で 1000 のブートストラップ複製を含むツリーを作成し、iTOL53 で視覚化しました。 アブラナ科の CLE33 のシンテニー分析は、Genome Context Viewer54 を使用して実行されました。 マルチシーケンス アライメント プロファイルは、alignmentviewer.org55 を使用して作成されました。 配列保存ロゴは WebLogo56 によって生成されました。

種子を、示された濃度のペプチド（Genescript、純度>75%、水に溶解）またはエストラジオール（ストック溶液をDMSOで希釈）または対応する溶媒を補充または補充していない1％糖半強度MSプレート上に置き、保存しました。 4 °C で 48 時間暗所に置いた後、22 °C の増殖チャンバーに移し、16 時間明/8 時間暗サイクルで培養しました。 ペプチドによる根の成長阻害アッセイの場合は 7 日間、brx-3/ops-2 の根の成長表現型の遺伝的抑制の場合は 10 日間、苗を生育させました。 Epson スキャナーで高解像度 (600dpi) でプレートをスキャンした後、フィジーの単一神経突起トレーサー ツールを使用して根の長さを測定しました。

CLE33 のプロモーター領域 (開始コドンから 876 bp) をクローン化し、GUS レポーター システムの発現を駆動しました。 トランスジェニック実生を、GUS 染色緩衝液 (0.5 mg/ml X-Gluc、100 mM リン酸緩衝液、10 mM EDTA、1 mM フェリシアン化カリウム、1 mM フェロシアン化カリウム、0.1% Triton X-100) 中で 37 °C でインキュベートし、透明化しました。エタノール70%。 画像は、Zeiss Axioplan 顕微鏡および Leica MDG36 実体顕微鏡を使用して撮影されました。

細胞特異的発現解析のために、CLE26 (1615 bp)、CLE45 (2513 bp)、および CLE33 (876 bp) の上流領域がクローン化され、H2B または NLS とシトリンからなる核局在融合の発現を駆動するために使用されました。 ペプチド処理の場合、ホモ接合トランスジェニック pCVP2:NLS-3xVenus 実生を、固定の 22 時間前に、ペプチドを含まない、または 100 nM の CLE33p または CLE45p を含む新しいプレートに移しました。

苗木をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で最低１時間固定した。 PBS で洗浄した後、サンプルを ClearSee 溶液 57 に溶解した 0.2% Calcofluor White で一晩染色し、ClearSee で少なくとも 48 時間透明化しました。 イメージングは​​、次の設定で Leica TCS SP5 レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して実行されました: カルコフルオル染色細胞壁 (405 nm で励起、415 ～ 500 nm で検出)、Venus ま​​たは Citrine (514 nm で励起、522 nm で検出) 574 nm または 524 ～ 600 nm）。

N.ベタミアナの葉を、pUbi:CLE33-mCherryおよびp35s:Venusを発現するマルチカセットプラスミドを保有するA.ツメファシエンスによる浸潤によって一時的に形質転換した。 3 日後、Leica TCS SP5 レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、金星 (514 nm で発光、524 ～ 551 nm で検出) および mCherry (561 nm で発光、571 ～ 650 nm で検出) について葉ディスクを連続的に画像化しました。

生後 5 日の苗を、1 μM エストラジオールまたは等量の溶媒 (DMSO) を含む新しいプレートに移しました。 16 時間後、苗木を液体窒素中で急速冷凍しました。 凍結サンプルを金属ビーズを使用したミルで粉砕しました。 MagMAX Plant RNA Isolation kit (Applied Biosystems) を使用して RNA を抽出しました。 残りのDNAを2M LiCl沈殿により除去した。 cDNA合成はSensiFAST cDNA合成キット(Meridian)を用いて実施した。 定量的 PCR は、補足表 1 のプライマーを使用し、Fast Start Universal SYBR-green Master (Roche) で実行されました。サーマル サイクラー (Mic qPCR Cycle、生体分子システム) の条件は次のとおりです: 95 °C 2 分、95 °C の 45 サイクル 15 s、58 °C 10 s、60 °C 50 s、続いて解離曲線分析。 発現値はアクチンに対して正規化されました。

Rstudio インターフェイス内で R v4.0.2 を使用して統計分析を実行しました。 根の長さと距離のQC-原師部細胞の同一性には対数変換を使用しました。 統計的有意性は、ANOVA とその後の多重比較のための事後 Tukey 検定によって決定されました。 ギャップセル周波数については、Benjamini-Hochberg P 値補正を備えた χ2 検定を採用しました。 一般に、サンプルサイズは予備実験で観察された変動に基づいて選択されました。 プレート上で生育した実生を含むアッセイでは、プレート効果のばらつきを制限するために条件ごとに複数のプレートを使用しました。 根の成長アッセイと根の原師部分析を少なくとも 2 回実行し、同様の結果が得られました。 CLE33 の発現パターンは、12 を超える T1 転写レポーター株に由来しています。 qPCR による発現解析は 4 回の技術的反復で 1 回実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究をサポートする補足データセットは Dryad に提出されており、このリンクを使用して見つけることができます: https://doi.org/10.5061/dryad.x69p8cznw。 これらのデータセットには、Excel ファイルにあるグラフやチャートの数値ソース データ、lif および lsm 形式の元の共焦点画像、fas 形式の遺伝子アライメントが含まれます。 すべての追加データは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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トランスジェニック系統 (pCVP2:NLS-Venus) と師部顕微鏡検査に関する技術的アドバイスを共有してくれた Bojan Gujas 博士に感謝します。 フリブール大学のバイオイメージコア施設とアドルフ・メルケル画像施設に感謝します。 この研究は、オハイオ州への Ambizione SNSF 助成金 (PZ00P3_179745)、オハイオ州への COST SNSF 助成金 (IZCOZ0_189892)、およびフリブール大学からオハイオ州への追加資金提供によって資金提供されました。

フリブール大学生物学部、Chemin du Musee 10、1700、フリブール、スイス

サミー・カーボネル、サルベス・コルネリス、オラ・ハザク

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S.カー。 そしてOHが研究を設計しました。 S.カー。 そしてS.Cor。 研究を実施した。 S.Car はデータを分析し、数値を作成しました。 OH が最初の草稿を書きました。 OH、S.Car.、S.Cor. 一緒に原稿を編集した。 OH 監修プロジェクト。 OHは資金を獲得した。

オラ・ハザク対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

この原稿は、別の Nature Portfolio ジャーナルで以前にレビューされています。 Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: David Favero。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Carbonnel, S.、Cornelis, S. & Hazak, O. CLE33 ペプチドは、シロイヌナズナの自己分泌および傍分泌シグナル伝達を介して師部の分化を抑制します。 Commun Biol 6、588 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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受信日: 2023 年 4 月 13 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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