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Jan 27, 2024

マルチオーム解析により、リソソームが健康を維持するにはレトロマーが必要であることが判明

9 giugno 2023 Il complesso retromero svolge un ruolo nello smistamento, nel trasporto e nella

2023 年 6 月 9 日

レトロマー複合体は、エンドリソソーム系を介してタンパク質の選別、輸送、廃棄を制御します。 神経変性疾患では異常が起こりますが、どのようにして異常が起こるのかはまだ不明です。 英国ブリストル大学のピーター・カレン氏とジェームズ・デイリー氏率いるマルチオミクス研究によると、レトロマーを欠く細胞では代謝が破綻する。 5月29日のNature Communications誌で、彼らは、細胞膜タンパク質が誤って分類され、リソソームが未消化の積荷で肥大化し、オートファジーが停止し、アミロイド前駆体タンパク質が蓄積することを報告した。 このバックアップにより、リソソームはエキソサイトーシスを介して過剰な内容物を細胞外に排出するよう促され、これにより、Aβ凝集体などの病原性タンパク質が細胞間で拡散する可能性があります。

「レトロマーと神経変性疾患における神経保護の役割を関連づける明確な証拠がある。この論文は、レトロマーの機能の複雑さと、それが神経保護にどのように役立つかを調査している」とカレン氏はアルツフォーラムに語った。

ワシントン大学シアトル校のジェシカ・ヤング氏は、「カレングループによるこのエキサイティングな新しい研究は、これらのメカニズムの解明において大きな進歩を遂げたところだ」とコメントした。

レトロマーは、細胞表面へのエンドソームのリサイクルとゴルジへの逆行運動を制御します。 コアレトロマータンパク質 VPS35 の変異は、AD およびパーキンソン病に関連していると考えられています (Rovelet-Lecrux et al., 2015; Jul 2011 news)。 レトロマーはアルツハイマー病の脳では死後に枯渇するが、細胞モデルや動物モデルでは複合体の欠損はAβおよびタウの病状の悪化と相関する（Small et al., 2005; Sullivan et al., 2011; Carosi et al., 2020）。

レトロマーが無効になったときに何が起こるかを体系的に研究するために、共同筆頭著者の Daly 氏と Chris Danson 氏はヒト神経膠腫細胞の VPS35 をノックアウトし、その後リソソームを LAMP1 で染色し、初期エンドソームを EEA1 で染色しました。 ノックアウト細胞では、両方の細胞小器官が腫れて変形していました。 透過型電子顕微鏡では、未消化の膜片が詰め込まれた拡大したエンドリソソームが示されました（下の画像を参照）。 後者は、AD、PD、およびレビー小体型認知症における肥大したエンドリソソームを彷彿とさせました（Cataldo et al., 2000; Shahmoradian et al., 2019; Crews et al., 2010）。

カレン氏とコメンテーターのボストン大学ジュリア TCW 氏は、単一のレトロマータンパク質を標的とすることでこれほど顕著な表現型が引き起こされることに驚いた。 ノックアウトの生細胞イメージングでは、大きなオートファジー性リソソームが時折ゆっくりと分裂する様子が捉えられました。 このプロセスにより細胞小器官が元のサイズに戻り、多数の細胞小器官が腫れていることが説明されます。

拡大したエンドリソソーム 。 正常なリソソーム (赤い矢印) とエンドソーム (青い矢印) は小さくて丸い (左)。 レトロマーノックアウト細胞（中央）には、破片で満たされた巨大で歪んだエンドリソソーム（黄色の矢印）が含まれていました（右）。 [Daly ら、Nature Communications、2023 年提供。]

これらのリソソーム内で何が問題になっていたのでしょうか? 科学者たちは、細胞全体と単離されたリソソームのプロテオームを分析しました。 前者では、477 個のリソソーム関連タンパク質が濃縮され、246 個が枯渇しました。 プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼなどの多くの加水分解酵素が減少しており、細胞老廃物を分解する能力が阻害されていることが示唆されました。

VSP35 陰性リソソームには、リソソームのエキソサイトーシスとエンドソームおよび常染色体との融合を制御する複数の加水分解性 Rab GTPase が積み重ねられていました。 また、リソソームのプロテオームには、微小管に引っ掛かり細胞内小器官を移動させるタンパク質である BORC 複合体のすべての構成要素が欠如していました。

Dimitrios Kapogiannis は、APP のプロセシングと代謝に関与するタンパク質の蓄積に特に興味をそそられました (以下のコメント)。 これは、海馬ニューロンの VPS35 を欠損したマウスで見られた所見を反映しています (2022 年 1 月のニュース)。

他の濃縮されたリソソームタンパク質は、AD、PD、およびその他の神経変性疾患に関与するネットワークおよびシグナル伝達経路にマッピングされました（下の画像）。 著者らにとって、これらの結果は、エンドソームおよび常染色体と融合したが、その内容物を分解したり、元の状態に戻ったりすることができていない停滞したAPPで満たされたリソソームを示唆している。

病気 病気。リソソームに豊富に含まれる多くのタンパク質は、神経変性疾患または関連プロセスに関連する経路に分類されました。 [Daly ら、Nature Communications、2023 年提供。]

停滞したリソソームは細胞表面プロテオームにも影響を及ぼしました。 VSP35ノックアウトでは、膜貫通タンパク質が本来あるべき場所、つまり膜で枯渇しているにもかかわらず、リソソームが豊富であり、膜タンパク質のリサイクルがバックアップされていることを示唆している。 一方、LAMP1 やニーマンピック C 型結合コレステロールトランスポーター NPCI などのリソソームタンパク質は、APP、β-セクレターゼ 2、および BACE が生成する APP C 末端フラグメントと同様に、細胞表面でクラスター化しました。 著者らは、タンパク質が細胞内で最終的に到達する場所のこうした変化はリソソームエキソサイトーシスを示していると考えている。

実際、細胞培地のプロテオームを測定すると、高レベルのリソソームタンパク質、APP、およびセクレターゼの他の基質が明らかになりました。 著者らは、老廃物の蓄積を補うためにリソソームエキソサイトーシスが増加するのではないかと考えています。 これにより、病原性タンパク質凝集体の細胞から細胞への拡散が促進される可能性があります。 科学者らは、この「セクレトーム」からのタンパク質がリソソーム機能不全の液体バイオマーカーになる可能性があると考えている（2020年12月のニュースを参照）。 「これらのデータは、リソソームだけでなく、従来の細胞外小胞やオートファゴソーム中間体の分泌が亢進していることを示唆しています」と、フロリダ州ジャクソンビルのメイヨークリニックの池津恒也氏は指摘した（コメントは以下）。

ニューヨーク州コロンビア大学のスコット・スモール氏は、セクレトームが細胞間のクロストークについて情報を提供できると考えている。 「セクレトームは神経変性疾患に最も関連していると思います。ニューロンから排出されたエンドリソソーム内容物がミクログリアやアストロサイトとのコミュニケーションを開始するためです。これがどのようにして裏目に出る可能性があるかを私たちは知っています」とスモール氏は述べた。

RNA 対タンパク質。細胞全体のトランスクリプトームおよびプロテオームレベルで下方制御または上方制御されたタンパク質は 14 個 (青色の文字) のみでした。 [Daly ら、Nature Communications、2023 年提供。]

トランスクリプトミクスにより、遺伝子発現とタンパク質濃度の間に断絶があることが明らかになりました。 VPS35 ノックアウトで摂動された数百のタンパク質のうち、転写レベルで上方制御または下方制御されたのは 14 つだけでした (上の画像)。 これにはカレンも驚きました。 プロテオミクスとトランスクリプトミクスは常に密接に相関しているわけではありません。 カレン氏は、ここでの断絶は、レトロマーノックアウトによって引き起こされる問題が転写ではなくタンパク質分解にあることを示していると考えている。 膜受容体ソルチリン、NPC1、プロテアーゼのカテプシンDなどのリソソームタンパク質をコードする遺伝子が、リソソームには存在しないにもかかわらず上方制御されていたということは、タンパク質輸送に問題があることを示唆している。

VPS35が再発現されると、レトロマーノックアウトエンドリソソームにおける形態学的、プロテオミクス、およびトランスクリプトームのすべての変化が元に戻りました。 「これは、私たちが見ている変化がレトロマー摂動の的を絞った効果を正確に反映していることを示しています」とカレン氏は述べた。

TCW にとって、このことはレトロマーを薬物標的として興味深いものにしていると考えています。 「多くの小分子がレトロマー機能を活性化するため、レトロマー機能を高める重要な上流および下流のタンパク質または転写因子を解明することが重要になるだろう」と彼女はアルツフォーラムに語った（2020年1月のニュースを参照）。—チェルシー・ワイドマン・バーク

複数のタンパク質を分類する複合体であるレトロマーと、AD や PD などの神経変性疾患との関連は古くから知られています。 しかし、経路は非常に複雑であるため、この関連のメカニズムを分析するのは困難です。

カレングループによるこのエキサイティングな新しい研究は、これらのメカニズムを解明する上で大きな進歩を遂げたところです。 VPS35 KO 細胞を使用し、リソソーム免疫沈降を実行することにより、リソソーム内細胞小器官および細胞表面に関連するタンパク質の変化を細心の注意を払って詳細に調べています。 データは、レトロマーの損失が細胞ストレスを促進し、リソソーム膜動態の解決の失敗とリソソームのエキソサイトーシスの増加による神経変性を引き起こす可能性があることを示しています。 これにより、潜在的な病原性タンパク質が細胞の外に放出され、隣接する細胞に凝集の種ができる可能性があります。

驚くべきことに、彼らのデータは、リソソームのアイデンティティの制御におけるレトロマーの役割も示しており、リソソームのアイデンティティが適切に取得されていない場合、細胞の代謝プログラムを変化させる可能性があります。 いくつかの研究では、AD表現型を改善するために小分子レトロマーシャペロンが使用されている（Mecozzi et al.、2014; Young et al.、2018; Mishra et al.、2022）。 細胞内のレトロマーによって調節される複雑なプロセスをより深く理解することは、この経路を治療的に標的とすることを目的とした研究に確かに役立つでしょう。

Mecozzi VJ、Berman DE、Simoes S、Vetanovetz C、Awal MR、Patel VM、Schneider RT、Petsko GA、Ringe D、Small SA。薬理学的シャペロンはレトロマーを安定化させて APP 処理を制限します 。 ナットケムバイオル。 2014 年 6 月;10(6):443-9。 Epub 2014 4 20 PubMed。

Young JE、Fong LK、Frankowski H、Petsko GA、Small SA、Goldstein LS. アルツハイマー病のヒト幹細胞モデルにおけるレトロマー複合体の安定化は、アミロイド前駆体タンパク質とは独立して TAU リン酸化を減少させる 。 幹細胞レポート。 2018 年 3 月 13 日;10(3):1046-1058。 Epub 2018 3 1 PubMed。

ミシュラ S、クヌップ A、木下 C、マルティネス R、テオフィラス P、ヤング JE. レトロマーの薬理学的安定化は、アルツハイマー病遺伝子 SORL1 の欠陥によって誘発されるエンドソーム病理を救う.2022 08 02 10.1101/2022.07.31.502217（バージョン1） bioRxiv。

レトロマー異常はアルツハイマー病の発症に関与していると考えられていますが、正確なメカニズムはまだ不明です。 Dalyらによるこの新しい研究は、 レトロマーとエンドリソソーム系の健康状態を結び付けることで、貴重な新たな洞察を提供します。 具体的には、この研究は、レトロマーのコアであるVPS35コンポーネントをノックアウトしたH4神経膠腫細胞が、ADで見られるものに似たエンドリソソーム系のさまざまな形態学的変化をどのように発現させるかを示している。

私は特に、VPS35 KO リソソームにおける APP の蓄積や、切断された APP の異常な蓄積など、APP プロセシングに関与するタンパク質の濃縮に関するプロテオミクスの発見に興味をそそられます。これは、レトロマー異常が Aβ 蓄積の上流にある可能性を示唆しています。

しかし、この研究には限界があり、特に主なモデルが腫瘍性細胞株であり、正常なニューロンの事象を完全には再現できない可能性があるという事実がある（ただし、著者らはマウス皮質の一次ニューロンを使用してモデルの生理学的関連性を確立しようとした） miRNA Vps35-BFP のプラスミドをトランスフェクトし、同様の形態学的変化を観察しました。

また、培養上清から細胞外小胞を単離し、そのプロテオーム解析を行わなかったことも機会を逸したと感じます。 多くのエキソソームタンパク質がこの上清のプロテオーム解析によって同定されたため、どのタンパク質が EV 関連であり、どのタンパク質がそうでないかを知ることは有益であったでしょう。

全体として、これは興味深い、潜在的に影響力のある研究であり、新しい洞察を提供し、新しい仮説を動機付けるものです。

これは、Vps35 欠損がどのようにリソソーム成分の蓄積につながるかを理解するために、マルチオミクスアプローチを使用した非常に包括的な細胞ベースの研究です。 LysoIP を実行するためのリソソームタグ付けに HA タグ付き Tmem192 を使用することは、従来の全細胞プロテオミクス、トランスクリプトミクス、および細胞表面および増殖培地「セクレトーム」中のビオチン化タンパク質のプロテオミクスと併せて、次のような新しいアプローチを提供します。統合されたオミクスベースの分析のための大規模なデータセット。

多くの興味深い発見の中でも、Rab27b が細胞内およびリソソーム内で最も顕著に濃縮されたタンパク質の 1 つであることを知ったのは非常に興味深いものでした。 Rab27bは、細胞外小胞（EV）の分泌に対する重要な調節因子であり（Ostrowski et al., 2010）、α-シヌクレインの非エキソソーム分泌も調節する可能性がある（Underwood et al., 2020）。 この研究は、Vps35 欠失によって引き起こされるリソソームの蓄積に焦点を当てていますが、このデータセットでは、リソソーム内の古典的な EV マーカー CD9 および CD81、増殖培地中の CD9、および細胞表面上の他の複数のテトラスパニン (TSPAN4、TSPAN6) の濃縮も示しています。 これらのデータは、リソソームだけでなく、従来のEVおよびオートファゴソーム中間体の分泌が強化されていることを示唆しています。

Vps35 KO 細胞のリソソームのタンパク質組成は、APP C 末端フラグメントと APP プロセシング酵素の大幅な濃縮も示しており、これは脳由来の EV でも見られます (Perez-Gonzalez et al., 2012; Muraoka et al., 2020) ）。 TSPAN6はアルツハイマー病の脳で増加し、C末端フラグメントをエキソソーム媒介分泌に分類する役割を果たしており(Guix et al., 2017)、脳内でのC末端フラグメントの蓄積にも関与している可能性があります。 Vps35 KO 細胞のリソソーム。 機能不全のリソソームとジストロフィー性神経突起に見出される病原性タンパク質の驚くべき重複を考慮すると、この研究は、ヒトアルツハイマー病脳およびアミロイドーシスのマウスモデルで見られるように、アミロイド斑周囲のジストロフィー性神経突起形成におけるVps35の重要な役割を示唆している。

オストロフスキー M、カルモ NB、クルメイヒ S、ファンゲット I、ラポソ G、サヴィーナ A、モイタ CF、シャウアー K、ヒューム AN、フレイタス RP、グード B、ベナロック P、ハコーエン N、福田 M、デスノス C、シーブラ MC、ダルチェン F 、Amigorena S、Moita LF、Thery C.Rab27a および Rab27b はエクソソーム分泌経路の異なる段階を制御します 。 ナットセルバイオル。 2010 年 1 月;12(1):19-30; 補足1-13ページ。 Epub 2009 12 6 PubMed。

Underwood R、Wang B、Carico C、Whitaker RH、Placzek WJ、Yacoubian TA。GTPase Rab27b は、α-シヌクレインの放出、オートファジークリアランス、毒性を制御します。 。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． 2020 6 5;295(23):8005-8016。 Epub 2020 4 29 PubMed。

Perez-Gonzalez R、Gauthier SA、Kumar A、Levy E. エキソソーム分泌経路は、アミロイド前駆体タンパク質のカルボキシル末端断片を細胞から脳の細胞外空間に輸送します 。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． 2012 12 14;287(51):43108-15。 パブメッド。

Muraoka S、DeLeo AM、Sethi MK、Yukawa-Takamatsu K、Yang Z、Ko J、Hogan JD、Ruan Z、You Y、Wang Y、Medalla M、Ikezu S、Chen M、Xia W、Gorantla S、Gendelman HE、 Issadore D、Zaia J、Ikezu T. アルツハイマー病ヒト脳組織の細胞外小胞のプロテオミクスおよび生物学的プロファイリング 。 アルツハイマー型認知症。 2020 6 月;16(6):896-907。 Epub 2020 4 17 PubMed。

Guix FX、Sannerud R、Berditchevski F、Arranz AM、Horré K、Snellinx A、Thathiah A、Saido T、Saito T、Rajesh S、Overduin M、Kumar-Singh S、Radaelli E、Corthout N、Colombelli J、Tosi S、 Munck S、Salas IH、Annaert W、De Strooper B. テトラスパニン 6: アミロイド前駆体タンパク質断片のエキソソーム放出とリソソーム分解を決定する複数小胞体の重要なタンパク質 。 モル神経変性者。 2017 3 10;12(1):25。 パブメッド。

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