定量可能なペプチドライブラリーは、乳がんに関するプロテオミクスに基づくバイオマーカーの発見と検証のギャップを埋める

Oct 03, 2023

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定量可能なペプチドライブラリーは、乳がんに関するプロテオミクスに基づくバイオマーカーの発見と検証のギャップを埋める

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8991 (2023) この記事を引用

358 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

質量分析 (MS) ベースのプロテオミクスは、バイオマーカーの発見に広く使用されています。ただし、多くの場合、発見されたバイオマーカー候補のほとんどは検証プロセス中に破棄されます。バイオマーカーの発見と検証の間のこのような不一致は、主に分析方法と実験条件の違いによるいくつかの要因によって引き起こされます。ここでは、検証プロセスと同等の設定でバイオマーカーの発見を可能にするペプチドライブラリを生成しました。これにより、発見から検証への移行がより堅牢かつ効率的になります。ペプチドライブラリーは、公共のデータベースから血液中で検出可能な 3393 個のタンパク質のリストから始まりました。各タンパク質について、質量分析での検出に適した代替ペプチドが選択され、合成されました。合計 4,683 個の合成ペプチドを純粋な血清および血漿サンプルにスパイクし、10 分間の液体クロマトグラフィー MS/MS 実行時間での定量可能性をチェックしました。これにより、452 のヒト血液タンパク質をカバーする 852 の定量可能なペプチドで構成される PepQuant ライブラリが誕生しました。 PepQuant ライブラリを使用して、乳がんの 30 の候補バイオマーカーを発見しました。 30 の候補のうち、9 つのバイオマーカー、FN1、VWF、PRG4、MMP9、CLU、PRDX6、PPBP、APOC1、および CHL1 が検証されました。これらのマーカーの定量値を組み合わせることで、乳がんを予測する機械学習モデルを生成し、受信者動作特性曲線の平均曲線下面積が 0.9105 であることを示しました。

血液タンパク質は、さまざまな病気の診断と予後を判断するための貴重な分析対象です1。特に、プロテオミクスプラットフォームの血液タンパク質への応用は、学術界と臨床業界の両方からますます注目を集めています2。質量分析およびデータ分析方法の技術開発により、MS ベースのプロテオミクスプラットフォームは、タンパク質を同定および定量するための深みと定量的強度を獲得しました 3。したがって、研究では、タンデムマスタグ（TMT）ベースの方法、ラベルフリー定量法、およびデータ非依存取得（DIA）方法を使用して、複雑なサンプルから多数のタンパク質を定量化し、発現の異なるタンパク質およびアイソフォームを潜在的な候補として同定してきました。新規バイオマーカー3、4、5。ただし、検証段階で有効であると特定されたのは、候補バイオマーカーのごく一部のみでした1。これは、承認され臨床で使用されているバイオマーカーの数にも見られました。同定された 4,300 を超える血漿タンパク質と比較して、多くの発見研究にもかかわらず、FDA によって承認または認可されたバイオマーカーはわずか約 100 です 2,6,7。発見段階と検証段階の間の不一致は、サンプルのサイズ、種類、数、準備プロトコル、および機器の違いによる可能性があります1,8。発見段階と検証段階の間のプロセスのうち、サンプルのサイズ、種類、数は実験計画段階でより適切に制御できます。しかし、装置ごとの準備方法の違いは実験計画法では解決できません。一般的な発見プロセスでは、プロファイリングされるタンパク質の数を最大化するために、豊富なタンパク質除去、前分画、および長いグラジエント実行時間 (1 ～ 3 時間) を備えた高分解能質量分析を使用した非ターゲットショットガンプロテオミクスアプローチが使用されます。対照的に、検証パイプラインは、定量的測定により重点を置いた、液体クロマトグラフィー - トリプル四重極タンデム MS (LC-MS/MS) による、純粋な血清または血漿に対するターゲットを絞ったアプローチに基づいています9。発見プロセスと検証プロセスの違いにより、臨床的に使用可能なバイオマーカーの発見にかかる時間とコストが増加します。

この問題を克服するために、以前の研究では、ナノフロー LC やマイクロフロー LC など、さまざまな種類の装置で再現可能な分析を可能にするプロトコルを使用することが提案されています 9,10。これらの研究は、非標的アプローチを使用した典型的な発見設定内で適切なバイオマーカー候補を生成することに重点を置いています。これにより、検出フェーズの時間が短縮される可能性があります。ただし、発見と検証の間のギャップは減少しません。

発見と検証の間のギャップを埋めるために、検証プロセスの設定でバイオマーカーの発見を可能にする PepQuant ライブラリを生成しました。このライブラリを構築するために、最初にペプチドのリストが作成され、存在することが知られているタンパク質、または公的データベースや論文から血中に分泌されるタンパク質から選択されました。 MS/MS による検出に有利なペプチドが選択され、化学合成され、ニート (高濃度のタンパク質が枯渇していない) 血清または血漿に対して多重反応モニタリング (MRM) モードを使用して 10 分間のグラジエントで定量されました。したがって、このライブラリは血液タンパク質からのペプチドで構成されており、ターゲット MRM モードを使用すると非常に短いグラジエント時間で検出できます。次に、乳がんバイオマーカーの発見と検証に PepQuant ライブラリを適用し、最終的に 9 つのバイオマーカーが得られました。同定されたバイオマーカー候補を使用してトレーニングされた機械学習 (ML) アルゴリズムは、受信者動作特性曲線 (ROC) 値の平均曲線下面積 (AUC) が 0.9105 で、乳がん患者と健常対照を区別しました。

PepQuant ライブラリを作成するために、まずヒトセクレトームデータベースと Blood Atlas 11、12 を使用して、血液中に存在する、または血液中に分泌される可能性のあるタンパク質を選択しました。また、235 個の疾患関連タンパク質も追加し、合計 3393 個になりました (図 1a)。このリストから各タンパク質のトリプシンペプチドのリストを作成しました。ペプチドの長さ、疎水性、修飾、および電荷を選択に使用しました（図1b）。選択基準により、短いグラジエント時間の過酷な条件下、および高濃度のタンパク質を枯渇させずに使用した血清または血漿などの純粋な条件下で、血液中でより検出可能である可能性が高いペプチドが特定されました。最初のライブラリ候補は、3393 個のタンパク質をカバーする 4683 個のペプチドで構成されていました。

Pep-Quant ライブラリの生成。 (a) Pep-Quant ライブラリーの生成プロセスを示す概略図。 (b) 血液中のタンパク質のリストからインシリコでペプチド候補を生成するプロセスを示す概略図。 (c) 血清および血漿からの Pep-Quant ライブラリー生成を使用して定量化されたタンパク質の数を示すベン図。

4683 個のペプチド候補の中から定量可能なペプチドを見つけるために、まず乳がん 40 個、膵臓がん 20 個、甲状腺がん 20 個、卵巣がん 20 個、肺がん 18 個、結腸直腸がん 20 個のサンプルと、さまざまな病院から収集した無病のサンプル 30 個の混合物を調製しました。血液サンプルの多様性。次に、前駆体イオンの保持時間 (RT) と、標準合成ペプチドと混合物中の内因性ペプチド間の上位 3 つのプロダクト y イオンピークを比較することにより、各ペプチド候補の MS クロマトグラムを分析しました。 4683 個のペプチドのうち、452 個のタンパク質をカバーする 852 個のペプチドは 3 を超える信号対雑音比 (SNR) で定量可能であり、95.60% の SNR は 10 を超えていました (補足データ 1)。また、タンパク質の約 75.22% が血漿と血清の両方で定量可能であることもわかり、このライブラリーが血清と血漿の両方に適用できることが示されました (図 1c)。

PepQuant ライブラリは、6 ～ 16 アミノ酸長のペプチドを含むように設計されており、LC-MS/MS 実行中の検出に有利です (図 2a、b)13。同じタンパク質内の他のペプチドは存在しないか、MRM 実行で検出されなかったため、16 アミノ酸を超えるか 6 アミノ酸未満の長さのライブラリーペプチドは 12 個のみでした。血漿と血清の両方のピーク強度を分析し（図2c、d）、選択したペプチドのダイナミックレンジを確認しました。これは強度が約103〜108 nmでした（図2c、d）。次に、各ペプチドの強度値をタンパク質の既知の濃度と比較しましたが、高い相関は示されませんでした（図2e）。ただし、研究混合物中の各タンパク質の濃度が Blood Atlas の濃度とは異なるため、これは予想されていました。さらに、このような違いは、プロテオフォーム、翻訳後修飾、アイソフォームの違いによって発生する可能性があります14。

Pep-Quant ライブラリの特性。 (a) ペプチド長と (b) ペプチド電荷の分布を示す棒グラフ。 (c) 血清および (d) 血漿の存在量ランクにおけるペプチドの強度を示すドットプロット。（ e ）血液アトラスからのタンパク質濃度とMRMモードでのその逆数強度との比較を示すドットプロット。 (f) Geyer et al.17 の Pep-Quant ライブラリー、DIA プロファイル実行、および DDA 実行で一般的に見つかるタンパク質の数を示すベン図。（ g ）P < 0.05の誤発見率補正による超幾何テストを満たすPep-QuantライブラリのGO機能強化ネットワーク。濃い青色は、機能するタンパク質がより多く濃縮されていることを示します。主要な機能または細胞コンポーネントのみが頭字語で示されています。 GO の完全な名前は補足図 S1 に示されています。 CY細胞質、MEM膜、Lum内腔、VS小胞、GR顆粒、PL血漿、LPリポタンパク質、ET細胞外。

PepQuant ライブラリのカバー範囲を検証するために、PepQuant ライブラリの生成に使用したものと同じ調製サンプルを使用して、データ独立取得 (DIA) 法によるノンターゲティングアプローチで同定されたタンパク質とタンパク質を比較しました。同定された 850 ～ 900 個のタンパク質のうち、271 個が DIA 分析で定量可能でした。そのうち、186 個のタンパク質が PepQuant ライブラリーでも見つかりました (図 2f)。これらのデータは、DIA 法を使用する高分解能装置 (orbitrap) と比較して、PepQuant ライブラリが人間の血液中の同数のタンパク質をカバーしていることを示唆しています。次に、PepQuant ライブラリ内のタンパク質を、Geyer らによって同定されたタンパク質と比較しました 15。そこでは、高解像度の機器を使用してニートの血液サンプルを定量化しました。 PepQuant ライブラリー内のタンパク質とプロファイリングも、Geyer らによって発見されたタンパク質と類似していました。サンプル、方法論、装置の違いにもかかわらず、15. これらの結果は、PepQuant ライブラリーを使用すると、高分解能装置と同等のパフォーマンスで血液中のペプチドの定量が可能になることを示しています。

次に、遺伝子オントロジー (GO) を使用して PepQuant ライブラリの機能強化を調査しました。 PepQuantライブラリタンパク質は、小胞、顆粒、リポタンパク質、膜を表すクラスター化ネットワークによって示されるように、セクレトームおよび細胞外領域が濃縮されました（図2gおよび補足図S1）。 PepQuant ライブラリーのタンパク質は、特定の疾患に偏ることなく、血液中の定量可能なタンパク質をできるだけ多く検出することを目的としているため、予想されていた単一のがんまたは疾患タイプの濃縮は見つかりませんでした。

PepQuant ライブラリによって迅速なバイオマーカー発見が可能になったことを確認するために、50 個の乳がんサンプルと 50 個の正常な血清サンプルに対してライブラリを分析しました。これにより、30のペプチドが0.05未満のP値で少なくとも1.20倍の変化を示しました（図3および補足表S1）。次に、LC-MS/MS を使用して、別の 96 個の乳がんサンプルと 95 個の正常サンプルのより大規模な個別のサンプルを使用して、30 個の候補の発現レベルを検証しました。 16 個のバイオマーカーは、倍率変化カットオフをより大規模に再現したため、さらなるテストに供されました (補足表 S2)。臨床試験におけるバイオマーカーとしてのペプチドの有用性をテストするために、分析性能の評価に進み、さまざまな条件下での精度、安定性、再現性をテストしました。 16 個のペプチド候補のうち、9 個が実行されたすべてのテストで再現可能な定量結果を示しました (補足表 S3)。選択されたバイオマーカーの最終セットには、FN1、VWF、PRG4、MMP9、CLU、PRDX6、PPBP、CHL1、および APOC1 が含まれていました (表 1)。

乳がんサンプルの PepQuant ライブラリ分析。 30 個のペプチドの Z スコアと倍率変化値を示すヒートマップ。50 個の乳がんサンプルと 50 個の正常サンプルのウィルコクソン順位和検定で、P 値が 0.05 未満で少なくとも 1.2 倍の変化を示しています。各ペプチドの最初の 3 つのアミノ酸配列が示されています。

次に、発見された 9 つのバイオマーカーを使用して、乳がんを予測するための ML モデルを生成することを試みました。トレーニングに使用されたサンプルは、187 人の健康な対照と 215 人の乳がんサンプルで構成されていました。合計 402 のサンプルがいくつかの機械学習モデルのトレーニングに使用されました。プールされたサンプルの 70% はトレーニングに使用され、30% はテストデータとして使用するために取っておかれました。バイアスを避けるために、サンプルは2つの技術的反復を使用してランダムシャッフルで測定されました（補足図S2）。すべてのアルゴリズムは、ホールドアウト法を使用して 5 回トレーニングおよび評価されました (補足図 S3)。 ML アルゴリズムの種類に関係なく、予測の平均 AUC 値は 0.88 を超え、CA15-3 および癌胎児性抗原 16 の分子ベースの診断検査の精度よりも高かった。 ML モデル間にパフォーマンスに有意な差はなく、バイオマーカーが乳がんサンプルと健康な対照サンプルを適切に区別したことを示しています。 ML モデルの中で、深層学習モデルはわずかに高いパフォーマンスを示し、平均 AUC は 0.9000 でした (補足図 S3)。

元のトレーニングデータとテストデータに 98 個の他のがんサンプルを追加することで、深層学習モデルをさらに開発しました (補足表 S4)。乳がん検出用にトレーニングされたモデルの平均 AUC 値は 0.9105 で、他のがんデータなしでトレーニングされたモデルの平均 AUC 値と同様でした (図 4a)。これらのデータは、トレーニングされたモデルが他のがんサンプルと混合されたデータから正常対照と乳がんサンプルを区別していることを示唆しています。モデルをさらに評価するために、乳がんのさまざまな段階の検査データの予測確率の分布をプロットしました。このモデルは、乳がんの初期段階を後期段階と同様のパターンで予測しました (図 4b)。全体として、これらのデータは、発見されたバイオマーカーと訓練されたモデルが、乳がんサンプルと正常な対照サンプルの区別において高いパフォーマンスを示したことを示しています。

乳がんの予測精度。 (a) 深層学習の曲線下面積 (AUC) 受信機動作特性 (ROC) グラフ。 (b) 正常、その他のがん、およびさまざまな段階の乳がんの乳がんサンプルの予測確率分布を示す箱ひげ図。

PepQuant ライブラリは、検証プロセスを促進し、発見から検証されたバイオマーカー候補の数を増やすように設計されました。これは、MRM モードでの 10 分間の実行で、ニート血清または血漿中の血液から定量できることがすでに確認されているペプチドで構成されるライブラリを生成することによって達成されました。したがって、PepQuant ライブラリにより、バイオマーカー検証と同じ実験設定でバイオマーカー発見のプロセスが可能になり、発見から各バイオマーカー候補を検証するために必要な時間とコストが大幅に削減されます。一般的なバイオマーカーの発見と検証の研究では、発見されたバイオマーカー候補の数は最大 50 ～ 100 に達する場合があります。これらの候補を検証するには、まずペプチド標準の合成と、少なくとも 50 ～ 100 の候補に対するメソッドの最適化が必要で、これには最大 6 か月かかる場合があります (図 5a)11。第二に、再現性を確認するために、検出可能かつ定量可能なペプチドをより大きなコホートで再度定量する必要があります。ただし、PepQuant ライブラリでは、メソッドの最適化が不要なため、最初のステップをスキップでき、再現性の確認ステップに直接ジャンプできます (図 5b)。さらに、PepQuant ライブラリ内のペプチドのリストは、検証条件で検出可能なペプチドのリストを提供することで、将来の研究に役立ちます (図 5c)。

(a) 一般的なプロセスと (b) PepQuant ライブラリを使用したバイオマーカーの発見と検証のプロセスを示す概略図。 (c) PepQuant ライブラリによってフィルタリングされた実験および公開データからの候補バイオマーカーの流れを示す概略図。

この研究では、PepQuant ライブラリを使用して、9 つの潜在的な乳がんバイオマーカーが発見されました。 9 つのバイオマーカー候補 (FN117、VWF18、PRG419、APOC120、CHL120、CLU21、PRDX622、PPBP23、および MMP924、25) はすべて、腫瘍細胞およびその微小環境変化に関連していることが知られています。 MMP9 は細胞外マトリックスタンパク質を分解することが知られているメタロプロテイナーゼであり、がん細胞浸潤のステップであることも知られています。これは腫瘍細胞内で上方制御され、乳がんの進行におけるEMT（上皮間葉転換）または腫瘍細胞の遊走を促進することが報告されています26、27。 MMP9 の過剰発現は、HER2 陽性トリプルネガティブ乳がんや転移性リンパ節でも見られました 28。 CLU は、細胞外液に豊富に含まれる糖タンパク質です。これはシャペロンのような特性を持ち、細胞死、炎症、組織再構築などのさまざまな細胞プロセスに関与しています。 MCF-7 細胞株での過剰発現による分泌 CLU に関する研究が行われました 29。過剰発現の結果は、腫瘍細胞の増殖が急速に増加し、肺に転移したことを示し、CLU の重要な役割が腫瘍増殖であることを示唆しています 29。乳がんに対する VWF、PRG4、および PPBP の役割は、腫瘍の進行と転移にあると予測されています。これら 3 つのタンパク質は異なる機能を持っていますが、3 つのタンパク質はすべてインテグリンと相互作用し、細胞増殖を誘導する PI3K/AKT および MAPK シグナル伝達経路の活性化につながります 18、19、23、30、31、32。あるいは、ケモカイン (CXC モチーフ) リガンド 7 としても知られる PPBP は、FAK の活性化とマトリックスメタロプロテイナーゼに作用して遊走と浸潤を促進します 23。別の研究では、組換え PRG4 発現がトランスフォーミング成長因子ベータ (TGFβ) を阻害することにより腫瘍抑制につながり、ヒアルロン酸 (HA) 細胞表面分化クラスター 44 (CD44) の減少につながることも示されました 33。 FN1 は受容体チロシンキナーゼなどのさまざまな成長因子受容体と相互作用し、過剰発現すると乳がんの予後不良につながります 34。 APOC1 および CHL1 は、以前の研究で血清中の乳がんのバイオマーカーとして発見されており、これは PepQuant ライブラリーからの乳がんバイオマーカーの発見および検証と相関しています 20。

乳がんの9つのバイオマーカー候補は、膜、小胞、顆粒などの細胞外領域やリポソームを含む複数の細胞成分に局在することが知られています（補足表S5）。それらは、小胞体（ER）-ゴルジ経路を通る標準的な分泌経路によって細胞外領域に分泌されると考えられています。 9 つのバイオマーカー候補の局在と機能的役割は細胞外領域で発生するため、それらは乳がんグループと同様に正常グループの血清でも検出されますが、発現には差があります。バイオマーカー候補の分泌と局在が研究されているにもかかわらず、純粋な血清状態で検出可能な乳がんの潜在的なバイオマーカーとしてこれまでに報告されているマーカーはわずか数個だけである。そのうち、3 つの乳がんバイオマーカー (APOC1、CA1、および CHL1) が以前の研究で発見され、乳がん検出アルゴリズム (Mastocheck®) のバイオマーカーとして使用されています20。 Mastocheck アルゴリズムは、臨床検証研究において感度 71.6%、特異度 85.3%、AUC 0.832 (正常 122、がん 183) で実行されます 35。対照的に、この研究で開発された ML モデルは、平均感度 87.9%、特異度 80.7%、AUC 0.9105 を示しました (表 2)。この結果は、9 つのバイオマーカーを含む開発された ML モデルが、現在の乳がん検出システムの効果的な代替または補助血液検査となり得ることを示しています。現在の乳がんの検出は効果的ではありますが、画像システムに大きく依存しており、高価で放射線被ばくのリスクがあり、高濃度乳房の場合は不正確です。

結論として、我々は、PepQuant ライブラリが、高分解能質量分析法を使用せずにヒト血液バイオマーカーを発見するための効果的な代替方法となり得ることを示しました。ターゲットを絞ったトリプル四重極マシンを使用する検証セットアップで発見を可能にすることで、バイオマーカーの検証中の効率と再現性が向上します。さらなる研究により、血液タンパク質およびペプチドに対する PepQuant ライブラリの範囲を改善することができます。生成された PepQuant ライブラリはタンパク質の選択に血液およびセクレトームに関する公開データベースを使用しましたが、ペプチドの選択に SRM アトラスなどのより多くの MS/MS データベースを使用することでさらに改善できる可能性があります。膜タンパク質または細胞質タンパク質のさまざまなタイプのタンパク質データベースを使用して、PepQuant ライブラリを拡張できます。検証設定により適したペプチド、MRM モードで定量可能、安定性が高く、タンパク質の代表的なペプチドが研究され、ライブラリに追加されます。全体として、バイオマーカーの発見と検証研究に役立つ PepQuant ライブラリを継続的に拡張する予定です。

各タンパク質について、考えられるすべてのトリプシンペプチドのリストが生成されました。トリプシンペプチドには、C 末端 RR (アルギニン-アルギニン)、KK (リジン-リジン)、RK、KR などのトリプシン切断耐性アミノ酸の組み合わせを含む配列を除く、両端に R または K を含むすべてのペプチドが含まれます。、KPとRP。このリストから、MS/MS による検出に適した特性を持つペプチドが選択されました。考慮された特性は、長さ、酸化、翻訳後修飾、および疎水性でした。 6 ～ 16 アミノ酸の長さのペプチドに高い優先順位が与えられ、他の長さと比較して典型的な MS/MS 結果でより高い割合で検出されました。極度に親水性または疎水性のペプチドは、保持時間の点で再現性が低いため、優先順位が低くなります。グリコシル化などの翻訳後修飾の可能性があるペプチドや、システイン (C)、メチオニン (M)、N 末端トリプトファン (W) などの不安定なアミノ酸を含むペプチドの優先順位は低くなりました。各タンパク質について、合成用のペプチド候補が選択されました。同様の優先順位を持つものがランダムに選択され、一部のタンパク質については、優先順位の高いペプチドが欠落しているため、優先順位の低いペプチド候補が選択されました。いくつかの目的のタンパク質に対して複数のペプチドが合成されています。すべてのペプチドは、医療試薬の適正製造基準施設 (Bertis Inc.、韓国) で合成されました。 4683 個のペプチドの最初のライブラリーは標識されておらず、452 個のペプチドはリジン 13C6、15N2 またはアルギニン 13C6、15N4 のいずれかで同位体標識されました。

血液から定量可能なペプチド候補を同定するために、6 種類の異なる癌 (乳癌 40、膵癌 20、甲状腺 20、卵巣癌 20、肺癌 18、 20 件の結腸直腸がん）と 30 件の健康な血液サンプル。内因性の血清/血漿標的ペプチドのスペクトルを合成標準ペプチド (未標識) のスペクトルと比較して、血清/血漿から定量可能なペプチドを同定しました。サンプル内の標的ペプチドを特定するために、標準とサンプルの標的ペプチドの上位 3 つのピークの比率が比較されました（補足図 S4a、b）。また、標準、サンプル、サンプルにスパイクされた標準における標的ペプチドの保持時間を比較しました（補足図S4c、d）。 LC 実行の 10 分間の保持時間内でシグナル対ノイズ比 (SNR) が 3 より高い場合、ペプチドは定量可能であるとみなされます。

乳がんの検出のために、韓国の 12 の病院から合計 500 の血清サンプルが収集されました。これらのうち、215 のサンプルは乳がん患者からのもので、187 のサンプルは健康な参加者からのものでした。残りの98サンプルはソウル大学病院のがん患者からのもので、がんの種類は卵巣(20)、胃(20)、膵臓(20)、肺(18)、結腸(20)の4種類であった。健康なサンプルは、BI-RADS (乳房画像報告およびデータシステム) でカテゴリー 2 (良性) としてリストされました。すべてのサンプルは、他のがんと診断されたことがないか、5 年以内に再発を経験していない患者からのものでした。

サンプルは、WHO国際臨床試験登録プラットフォーム（ICTRP）のメンバーである韓国臨床研究情報院に登録された前向き多施設臨床試験のために2019年8月から2020年9月まで収集された。識別番号は KCT0004847 です。各病院の検体数は以下の通り：ソウル大学病院(187)、ソウル大学盆唐病院(14)、檀国大学病院(27)、中央大学病院(26)、翰林大学江南聖心病院(13)、国立がん研究センター (22)、ミョンジ病院 (25)、漢陽大学病院 (9)、韓国カトリック大学ソウル聖母病院 (11)、高麗大学校安岩病院 (14)、高麗大学校九老病院（２９人）、慶尚大学病院（２５人）。他のがん血清サンプルは、Human Materials Repository を使用した非臨床研究として、ソウル大学病院の治験審査委員会 (IRB No. H-1911–085-1079) によって承認されました。他のがん血清サンプルは、ヒューマンマテリアルリポジトリを使用した非臨床研究として、ソウル大学病院の治験審査委員会によって承認されました (承認番号 H-1911-085-1079)。すべての参加者からインフォームドコンセントを得ました。この研究はヘルシンキ宣言に従って実施されました。

全血を23Gシリンジを用いた静脈穿刺によって採取し、血清および血漿についてはそれぞれ「バキュテナー」血清分離管およびEDTA採血管(BD、米国、ニュージャージー州)に移した。それらを 4 °C、2100 × g で 20 分間遠心分離し、上清層を新しいチューブに移し、-80 °C で保存しました。質量分析の前に、凍結サンプルを 4 °C で完全に解凍し、軽くボルテックスしました。

豊富なタンパク質を枯渇させることなく、そのままの血清サンプルを直接使用しました。分離したサンプル 5 μl を、18 mM ジチオスレイトール (Sigma-Aldrich、米国、マサチューセッツ州) を含む 8 M 尿素溶液に添加し、35 °C で 90 分間インキュベートしました。サンプルを室温まで冷却し、ヨードアセトアミド（Sigma-Aldrich、米国、マサチューセッツ州）を濃度 26 mM で添加し、暗所で RT で 30 分間インキュベートします。重炭酸アンモニウム (Sigma-Aldrich、米国、マサチューセッツ州) を添加して (最終濃度: 100 mM)、尿素濃度を 1 M 未満に希釈しました。5 μg のトリプシン (配列決定グレード、Promega、米国、ウィスコンシン州) を添加し、続いてタンパク質消化のために 37 °C で 16 時間インキュベートします。トリフルオロ酢酸 (Thermo Fisher Scientific、米国、マサチューセッツ州) を溶液に添加して、トリプシン活性をクエンチしました (最終濃度: 1%)。メーカーの指示に従って、C18 カートリッジ (Sep-pak C18、100 mg、Waters) を使用してサンプルをクリーンアップしました。洗浄したサンプルは完全に乾燥させ、使用するまで -80 °C で保管しました。 MS/MS 分析の前に、乾燥サンプルを 0.1% ギ酸に再懸濁しました。

使用した質量分析計は、Qtrap5500 Plus (Sciex、米国、マサチューセッツ州) でした。 LC 分離には、C18 逆相カラム (0.5 mm × 150 mm、3.5 μm、Agilent、米国、カリフォルニア州) を使用し、ポジティブ MRM モードで分析を実行しました。流量は 20 μL/分、グラジエント構成は 0 ～ 10 分間 5 ～ 30% に設定されました (グラジエント時間は 10 分)。各イオン化ペプチドの質量分析パラメーターの衝突エネルギー (CE) 値は、SKYLINE ソフトウェア (https://skyline.ms/project/home/begin.view) を使用して決定されました。質量スペクトルおよびクロマトグラフィー分析は Analyst (1.7.2) を使用して実行され、使用された定量プログラムは Multiquant (3.0.2) でした。

消化されたペプチドは、Ultimate 3000 UPLC (Thermo Fisher Scientific、米国、マサチューセッツ州) と組み合わせた Q Exactive Hf-x Orbitrap 質量分析計を使用して分析されました。プロテオーム DIA 分析では、実行時間を 130 分に設定し、UPLC 勾配を次のように設定しました (T min/溶媒 B の%): 0/3、5/3、80/20、105/40、105.1 /80、115/80、115.1/3、130/3。ペプチドは、2 μm C18 粒子が充填された EASY スプレーカラム (50 cm × 75 μm ID) を介して 1.5 kV の電位でイオン化されました。全 MS スキャン範囲は 300 ～ 1400 m/z に設定され、解像度は m/z 200 で 60,000 に設定されました。MS2 スキャン範囲は 300 ～ 1400 m/z に設定され、25 m/z の 44 ウィンドウが使用されました。自動利得制御の目標値は 3.0 × 106、最大イオン注入時間は 100 ms に設定されました。

DIA データを分析するには、まず生ファイルを mzML に変換し、DIA-NN36 にインポートしました。 12,046 個のタンパク質を含むスペクトルライブラリは SWATHAtlas (www.swathatlas.org) からダウンロードされました。ライブラリ検索は、前述した DIA-NN マニュアルに従って実行されました 36。簡単に言うと、プリカーサーとフラグメントイオンの m/z 範囲は 300 ～ 1400 に設定され、プリカーサーの電荷範囲は 2 ～ 6 に設定されました。ペプチド修飾については、短期間のメチオニン切除とシステインカルバミドメチル化のみが考慮されました。切断の失敗は 2 つまで許容され、前駆体の誤検出率は 1% に設定されました。 MS1 精度とスキャンウィンドウにはデフォルトパラメータ 0.0 が使用されました。

乳がんバイオマーカーを同定するために、PepQuant ライブラリを構成するすべてのペプチドを、全サンプルからランダムに選択した 50 人の健康なサンプルと 50 人の乳がん患者のサンプルに対してテストしました。少なくとも 1.2 倍変化の差を持つペプチドが最初に選択されました。選択された候補は、追加の健康な 95 サンプルと乳がん患者 96 サンプルを使用して定量化されました。乳がんサンプルと健康な対照サンプルの間で少なくとも 1.2 倍の変化差を満たすペプチドを分析性能評価に供しました。

タンパク質マーカーの LC-MS/MS 定量化の分析性能評価は、臨床応用にとって不可欠な要素です 37。分析性能のパラメータは主に直線性、精度、選択性、精度、サンプルの安定性で構成されます9。直線性は、ペプチドの少なくとも 6 つの異なる濃度について一次方程式を導出し、定量値と一次方程式から得られる推定値の間の決定係数 (R2) を計算することによってチェックされました。精度は、各集中点について、一次方程式からの推定値と定量値との比を計算することによって得られました。 6 つの濃度ポイントのうち少なくとも 5 つが精度値の ± 20% 以内にある場合、ペプチドは許容可能であると見なされます。日内精度と日間の精度は、それぞれ 1 日以内と数日以内に、5 回の技術的反復で異なるサンプル濃度でペプチドを繰り返し測定することによってテストされました。 80 °C および 4 °C で 7 日間保存した後のサンプルペプチドの安定性もテストしました。すべての実験では、同位体標識合成ペプチドを内部標準 (IS) として使用しました。分析物（ペプチド）対 IS の比に特定量の IS を乗じて、分析物濃度を決定しました（補足表 S3）。

診断アルゴリズムは、深層学習、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、光勾配ブーストアルゴリズムを使用して開発されました。ロジスティック回帰およびランダムフォレストアルゴリズムは、「Scikit learn v. 0.23.2」38 を使用してデフォルトのパラメーターでトレーニングされました。勾配ブースティングアルゴリズムには、Python モジュール「Lightgbm v. 3.2.1」が使用されました。すべての機械学習モデルは、アルゴリズムのトレーニングと評価に 5 つの異なるランダム状態を使用するホールドアウト法を使用して反復テストされました。深層学習アルゴリズムは、Torch v. 1.7.1 を使用して開発されました。特に明記されていない限り、すべてのアルゴリズムは Python v. 3.8.13 環境 39 を使用して開発されました。深層学習モデルの構造は GrowNet に似ており、現在のデータセットに合わせて簡単に調整されました40。

この研究で生成されたデータは補足データ 2 で入手でき、PASSEL (http://www.peptideatlas.org/passel/)、データセット ID PASS04818 にアップロードされます。

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