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Jul 13, 2023

βの解析

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9180 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

β 神経成長因子 (NGF) は、妊娠中の胎児の発育に重要な役割を果たすニューロトロフィンです。 ProNGF は、独特の生物学的プロファイルを持つ NGF の前駆体です。 妊娠中のヒト女性における NGF と proNGF の役割を調査するために、高感度で選択的な免疫親和性液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析アッセイが開発され、総 NGF (tNGF; 成熟 NGF と proNGF の合計) と proNGF のレベルを同時に測定できるようになりました。それぞれ完全な定量化戦略と相対的な定量化戦略を使用します。 このアッセイを使用して、妊娠の 3 期の妊娠期間および非妊娠女性対照における血清 tNGF および proNGF レベルを測定しました。 平均 tNGF ± SD は、非妊娠期、妊娠初期、妊娠中期、妊娠後期でそれぞれ 44.6 ± 12.3、42.6 ± 9.3、65.4 ± 17.6、および 77.0 ± 17.8 pg/mL であり、対照群と妊娠期の間で循環 tNGF に有意な増加がないことが示されました。妊娠第 1 期、妊娠期間中は​​中程度だが大幅に 1.7 倍に増加します。 妊娠第 1 期中の proNGF レベルは、対照と比較して変化しませんでした。 しかし、tNGF とは対照的に、妊娠中の proNGF レベルは大きな変化なく安定したままでした。 tNGF と proNGF の両方に対するこの高感度で新しい免疫親和性二本鎖アッセイの開発により、これらのニューロトロフィンがヒトの妊娠や他のモデルにおいて果たす役割のさらなる解明が可能になることが期待されます。

β-神経成長因子 (NGF) とその前駆体 proNGF は、異なる機能を持つ重要なニューロトロフィンです。 NGF はニューロンの成長、発達、分化を促進し、一般に神経保護作用があります 1 のに対し、proNGF は一見矛盾する機能を持ち 2、正常と比較して甲状腺がんでは過剰発現していることが判明しています 3。 発表された報告書では、ニューロンの成長と生存の両方がサポートされている 4,5 だけでなく、ニューロンの死もサポートされていることが示されています 6,7。 proNGF は脳内に存在する主要な形態であり、成熟 NGF はほとんどまたはまったく存在しません 8,9。 興味深いことに、神経細胞におけるプロNGFと成熟NGFの比率の役割10、11、およびその後のこれらの異なるタンパク質による受容体発現およびシグナル伝達の役割8、12、13は、神経変性状態における重要な因子であると思われる14、15。 2 つのタンパク質は平衡状態で存在しており、そのバランスが変化すると、互いに拮抗的に機能する可能性があります 16。 例えば、NGF の成熟不全により、ラットの脳内で proNGF と成熟 NGF の比率が高くなり、実験的に誘発された糖尿病性脳症の早期進行に寄与します 17。 さらに、proNGF と成熟 NGF の間の不均衡な比率は、一般的に糖尿病による合併症の初期指標であると思われます 18。 NGF の不適切な調節や機能不全は、アルツハイマー病 19,20,21,22、加齢黄斑変性症 23,24,25,26、網膜損傷 27、多発性硬化症 28 などの神経変性疾患にも関係している可能性があり、NGF は、神経変性疾患緑内障における治療上の役割24． NGF が発見され単離されて以来 29,30、NGF は神経系の発達に影響を及ぼし 31,32,33、成人の侵害受容調節において重要な役割を果たしていることが認識されています 34,35。 したがって、NGF はその治療上の重要性について広く研究されており、侵害受容性疼痛および腫瘍学における潜在的な治療標的としてますます追求されています 36,37。

ニューロトロフィンは、妊娠に関連するプロセスにも関与しています。 母体と胎児の両方の NGF 発現は、妊娠の第 1 期から第 3 期にかけて上昇することが示されており、卵子の着床と妊娠後期における母体の血管分布の増加の両方に重要な役割を果たしていることが示唆されています 38,39。 NGF の補給は、特定の哺乳類で子宮内膜の血管新生を増加させることが示されています 40。これは、子癇前症での出産における胎盤循環における NGF の上昇に対する血管新生の代償を説明できる可能性があります 41。一方、臍帯血漿および胎盤の NGF レベルの低下は早産と関連しています 42。 さらに、オピオイド中毒などの外部要因によるNGFレベルの低下は、認知異常、新生児死亡、呼吸器疾患、アプガースコアの低下など、妊娠の有害転帰が著しく高くなることに関連している43。

proNGF と成熟 NGF の比率も、上で概説した神経変性疾患における役割と同様の役割を果たす可能性がありますが、おそらく妊娠中の子宮交感神経の破壊と、産後の回復中の子宮神経の再神経支配に関与していると考えられます 44,45。そして、胎盤組織における不均衡な NGF 分布は、ヒトの流産と関連しています 46。 NGF レベルは、臍帯血 (1 日目の最初の減少後) と比較して 4 日目のヒト新生児で上昇していることが示されましたが、他のニューロトロフィンは大幅に減少しました 47。 特定のインターロイキンとインスリン抵抗性および分泌との正の関連に加えて、NGF は妊娠糖尿病患者で高く、妊娠第 2 期の中国人妊婦のグルコース代謝、インスリン抵抗性、膵臓 β 細胞機能と強く関連しています。

NGF の LCMS アッセイを使用した以前の研究では、カニクイザルの妊娠中に NGF 発現が大幅かつ継続的に増加する (最大約 78 倍) ことが実証されており、雄と非妊娠雌対照群の間で循環レベルに差はありません 48。 カニクイザルでは循環 tNGF レベルの大幅な増加が示されていますが 48、この現象はヒトの妊娠では報告されておらず、これは妊娠中の種特有の違いを示していると思われます。 最適な妊娠の進行には全身の NGF レベルのバランスが重要ですが、ヒトの正常妊娠と単離された栄養膜細胞からの自然流産患者における NGF mRNA 発現は、後者で約 2 ～ 8 倍の増加を示しました。 この結果は、妊娠初期に超生理学的用量の NGF を投与したマウスモデルにおける自然流産と一致し 46、妊娠後の授乳中のマウスでは NGF レベルが増加することが示されています 49。 興味深いことに、ラットの子宮内の NGF レベルは、対照と比較して妊娠中期および後期に減少しており、これは既知の子宮筋層神経変性と相関しています 45。 同様に、NGF 発現は糖尿病で上昇しており、糖尿病性神経障害および血管障害の保護因子であることが示されています 50,51,52,53 が、妊娠中期の妊娠糖尿病の中国人女性でも上昇しており、インスリン抵抗性に関与していると考えられています 54。 Lobos らはまた、おそらくプロ型から成熟型へのプロセシングの障害により、妊娠中に proNGF レベルが増加することを実証しました 44,45。

前述の研究を総合すると、妊娠中の NGF と proNGF のさまざまな役割についての知識が深まりました。 しかし、NGF および proNGF 分析は概して、適格な選択的アッセイを行わずに実施されており、報告されたデータセットは比較可能であると同時に相違しているように見えます。 したがって、報告されている NGF 濃度と proNGF 濃度の違い、したがって到達した結論が、少なくとも場合によっては、アッセイの違いやばらつきによって混乱する可能性があるかどうかは未確認のままです 16。 これは、結論に対する信頼を得るために、proNGF および NGF アッセイを特徴付け、潜在的に改善し、適格性を確認する必要性を強調しています 16。

ヒト血清中の tNGF の定量化に以前に認定された免疫親和性液体クロマトグラフィータンデム質量分析 (IA-LC-MS/MS) アプローチを利用して 55,56,57、我々はアッセイを拡張して proNGF の相対定量を含めました。 高度に選択的で感度の高い質量分析アッセイを使用したこの分析により、ヒトの妊娠中の tNGF レベルを確認し、前駆体タンパク質の相対的な定量的測定を組み込むことを目的としています。 proNGF を識別するアッセイの能力により、妊娠中の proNGF 血清レベルの変化を評価することができます。 我々はこのアプローチを使用して、各妊娠期間の中間点付近の妊婦の血清中のtNGFおよびproNGFレベルを非妊娠女性コホートと比較して評価しました。 このデータは、ヒトの妊娠における妊娠中の NGF と proNGF の役割をさらに理解するために使用できます。

proNGF タンパク質を等モルで表現するには、proNGF の代替ペプチドが必要でした。 つまり、proNGF 1 mol ごとに、トリプシン処理後に代替ペプチド 1 mol を生成する必要がありました。 proNGFのプロペプチド領域に由来するトリプシンペプチドVLFSTQPPRは、本明細書に記載のアッセイの目的を満たす特定の基準、すなわち主にNGFの成熟型には存在しないドメインにおけるproNGFペプチドに対する特異性、に基づいて選択された。 第二に、高い予測抗原性により、特異的な抗ペプチド抗体の生成が可能になります。 最後に、質量分析計で堅牢なシグナルを実現する機能です。 この研究で使用された 2 番目のトリプシンペプチドは IDTACVCVLSR で、これは以前に NGF 測定の LC-MS/MS アッセイで使用されていました。ペプチド IDTACVCVLSR の選択基準は以前に説明されています 55。 このペプチドは、成熟 NGF タンパク質と proNGF タンパク質の両方の C 末端近くに由来するため、組み合わせた tNGF 測定において両方のタンパク質形態からの寄与を表します。

アッセイの開発には必要であり、このアッセイに使用される捕捉抗体は、成熟 NGF とプロ NGF の両方に結合できなければなりません。 ポリクローナル捕捉抗体の両方のタンパク質への結合は、両方の代替ペプチドの特異的検出によって確認されます。 さらに、認定研究の前に、ヒト血清からの抗体濃縮後の上清の繰り返しのプローブにより、捕捉抗体が両方のタンパク質形態をほぼ完全に回収していることが確認されました。

このメソッドは、別々の日に実行される 3 回の個別のバッチ実行で認定されました。 ヒト血清中の tNGF の定量範囲は、相対精度許容基準 < 25% (LLOQ では 30%) を使用して 10.0 ～ 640 pg/mL です。 8 つの校正標準濃度レベル (0 点を含む) が最終曲線で表され、最低 6 つの非ゼロ点が必要でした。 アッセイ適格性評価中に得られる典型的な検量線を図 1A に示します。 すべての校正標準の CV 範囲は 4.80 ～ 16.6%、RE 範囲は - 5.20 ～ 12.4% でした。 3 つの個別のバッチ実行を通じて、4 つの個別の校正点のみが校正曲線から削除されました。 許容範囲を超えて個々の曲線点が削除され、曲線の当てはめが再回帰しました。 tNGF の精度と相対精度は、認定研究全体を通じて同じ血清ロットで評価され、アッセイ間平均 30.0 pg/mL (QC2; 内在性 tNGF レベル) が得られ、QC2 の 2 倍希釈 (QC1) ではアッセイ間での精度が得られました。平均12.8 pg/mL。 スパイクされたＱＣ、すなわちＱＣ３およびＱＣ４については、ＱＣ２におけるＮＧＦの内因性レベルについて決定されたアッセイ間平均をスパイクされたＮＧＦ濃度に加えて、相対精度を計算した。 tNGF の個別、アッセイ内およびアッセイ間の QC データと要約統計量を表 1 に示します。

(A) tNGF の代表的な検量線。 (B) 妊娠サンプル中の tNGF (1) 対照、(2) 第 1 学期、(3) 第 2 学期、(4) 第 3 学期。 (C) proNGF (1) コントロール、(2) 第 1 学期、(3) 第 2 学期、(4) 第 3 学期。

スパイクされたＱＣ、すなわち、ＱＣ３およびＱＣ４については、ＱＣ２におけるｔＮＧＦの内因性レベルについて決定されたアッセイ間平均が、相対精度を計算するためにスパイクされたＮＧＦ濃度に加えられた。 tNGF の個別およびアッセイ間の QC データと要約統計量を表 1 に示します。

proNGF の精度と相対精度は、tNGF 認定に使用したのと同じ 3 つのバッチで、3 つの別々の日に 5 つの異なるレベルで実証されました。 表 2 に示す値は、軽いペプチドのシグナルに対する重いペプチドのシグナルのピーク面積比 (PAR) です。 相対精度の尺度としてのパーセント相対誤差 (RE %) は、低 QC と高 QC (proQCL および proQCH) について実験的に決定された平均 PAR 値を使用して計算され、実験値と混合 QC (proQCM1) の外挿理論的 PAR 応答を比較しました。 、proQCM2 および proQCM3)。 proNGF 認定 QC のアッセイ間平均、CV % および RE % は、proQCL 0.0699、18.4% (RE なし) でした。 proQCM1: 0.115、25.6%、19.1%; proQCM2: 0.131、22.4%、7.09%; proQCM3 0.156、15%、4.69%; proQCH: それぞれ 0.175、18.2% (RE なし)。 proNGF のアッセイ間の CV 範囲は 15.0 ～ 25.6%、RE 範囲は 4.69 ～ 19.1% でした。

認定実行 1、2、および 3 では、proQCH と proQCL 間のシグナルにそれぞれ 2.6、2.5、および 2.0 倍の差が観察され、認定を通じて平均 2.37 倍の差が得られます (図 2)。

proQCL と proQCH を混合することによって生成されたすべての proNGF QC の平均 proNGF L:H PAR (軽ピーク:重ピーク面積比) は、proQCL から proQCH への proNGF L:H PAR の 2.37 倍の増加を示します。

サンプルの分析中、QC および未知のすべての tNGF 値は、4 つの反復検量線を使用して 2 つの 96 ウェル プレートで並行して実行され、QC サンプルは 2 つのプレートに分割されました。 相対誤差は、分析日に QC2 について測定された内因性レベルを使用して計算され、スパイクされた NGF の量に加算されました (表 S1)。 proNGF QC は、理論値を計算するための適切な混合スキームで proQCH と proQCL の平均を使用し、分析日に proQCL および proQCH について測定された proNGF レベルによって決定される名目濃度からの CV および相対誤差に基づく合格基準に合格しました。 proQCM2 の比率 (表 S2)。

コホートにおける tNGF および proNGF の値は、妊娠していない対照と同様に妊娠期間ごとにグループ化されています (図 3)。 データは、対照群から妊娠第 2 期および妊娠第 3 期にかけて循環 tNGF レベルが大幅に増加していることを示していますが、同じグループでは循環 proNGF レベルに有意な増加はないことが示されています。 tNGF と有意に関連する共変量は見つかりませんでした。 103 人の患者全員から年齢情報を取得し、両方のペプチドについて年齢に関連した分析を実施しました。 tNGF データを持つ 103 人の患者の間では、個々の被験者の年齢と tNGF の間の順位相関は -0.153 で、p 値は 0.126 でした。 個々の被験者の年齢とｐｒｏＮＧＦとの間の順位相関は０．１２４であり、ｐ値は０．２２０である。 線形回帰モデルでは、妊娠期間を調整すると、tNGF と年齢の間に有意な関連性はなく、p 値は 0.079 です。 またはproNGFと年齢の間で、p値は0.173です（図S1）。 選択された非妊娠対照、妊娠第１、第２および第３学期対象者からのｔＮＧＦおよびｐｒｏＮＧＦの代表的なイオンクロマトグラムをそれぞれ図１Ｂ、Ｃに示す。 ヒト妊娠コホートの tNGF および proNGF の個々の値は、補足情報に記載されています (それぞれ表 S3 および表 S4)。

(A) 非妊娠コホートおよび妊娠コホートにおける tNGF および (B) 妊娠期間ごとの proNGF レベル。 各プロットの下には、各グループの平均値と標準偏差 (SD)、および対照 (非妊娠) グループと比較した p 値が示されています。 線は各グループの平均を示します。

このレポートでは、妊婦および非妊娠女性のコホートの IA-LC-MS/MS55 を使用したヒト血清中の tNGF の定量測定と、二重アッセイで同じ方法論を利用した proNGF の新規相対定量の両方について説明します。フォーマット。 IA-LC-MS/MS アッセイでは単一の捕捉抗体試薬のみが必要であるため、アッセイを二本鎖フォーマットに適応させることで、1 回の実行で両方のタンパク質の測定が可能になりました。 対照血清で測定された血清 tNGF の基礎レベルは、IA-LC-MS/MS55 で以前に検出されたレベルに匹敵し、NGF に対する高感度リガンド結合アッセイが使用されていますが、以前に発表されたいくつかの方法よりも 10 倍高い感度まで測定可能でした。 ELISA研究58。

ここで我々は、平均 tNGF レベルが非妊娠対照と妊娠第 1 期の間で大きく変化しないことを実証します。 しかし、レベルは第 1 学期から第 2 学期にかけて増加し、第 2 学期から第 3 学期にかけても緩やかながらも増加しました (それぞれ 1.5 倍と 1.1 倍) が、p 値に基づく統計的有意性がありました (図 3)。 非妊娠対照群と比較した妊娠最終期からの全体的な平均増加は 1.7 倍であり、p 値に基づくと有意でした。 この増加は、アッセイ認定中に確立された観察された変動よりも大きかった。 これまでの研究では、ヒトの妊娠中の循環成熟NGFレベルのわずかで有意ではない変化が示されており59,60、この研究に含まれるデータは、妊娠期間中のtNGFの小さいながらも有意な増加を示していますが、以前に発表された値と概ね一致しています48。 59.

p 値に基づくと、proNGF レベルは妊娠期間を通じて大きく変化しませんでした。 循環プロNGFレベル（または切断された誘導体）はELISAによって測定可能であり、疾患状態に応じて変化することが示されているが、アッセイの生物分析的特徴付けは不足している61。 これまでに、proNGF レベルはマウスの子宮組織で妊娠中に増加することが示されていますが、NGF レベルの種間変動で見られたように、種間の絶対循環値の観点から proNGF レベルを比較することは困難である可能性があります 45。 proNGF レベルは、ラットで観察されたようにヒトの妊娠では確かに増加しませんでした 45 。これは、種間の妊娠における proNGF の役割の潜在的な一般的な違いを強調しています。 ただし、このことは、成熟 NGF または proNGF レベルで観察された変化が生物分析の問題によって混乱されていないことを確認するために、慎重に適格なアッセイを使用する必要性も強調しています。

今回我々は、tNGF と proNGF を同時に測定できる高感度で選択的な LC-MS/MS 法を確立します。これにより、妊娠、神経系の発達、疾患におけるバイオマーカーとしてのさまざまな役割におけるこれらのニューロトロフィンの測定に特異性がもたらされます。現在利用されているテクノロジーと比較して状態を示します。

凍結乾燥組換えヒトβ神経成長因子 (rhβ-NGF) (カタログ番号 256-GF-100; R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス) を 0.2% ウシ血清アルブミン (カタログ番号 Millipore-Sigma、マサチューセッツ州バーリントン) で 10 分間調製しました。 mM リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4。 BioIVT からの大量のヒト血清がプールされました (Various、ニューヨーク州ウェストベリー)。 安定同位体標識ペプチド NGF-H2N-AWRFIRIDTACVCV[+7 Da]L[+6 Da]SRKAVRRA-OH (New England Peptides、マサチューセッツ州ガードナー)、および proNGF-H2N-LRSPRVLFSTQPPR[+10 Da]EAADT-OH (Thermo) Fisher Scientific (マサチューセッツ州ウォルサム)) をアミノ酸分析によって定量し、-80 °C で 5 nmol/mL で保存し、それぞれ 6.67 および 1.67 pmol/µL の濃度で内部標準ペプチド原液を生成し、さらに希釈しました。それぞれ0.90および0.23 fmol/μLまで。 ヤギポリクローナル抗β-NGF 抗体 (カタログ番号 AF-256 R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス) を、PBS 中の EZ-link Sulfo-NHS-LC-ビオチン (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific、イリノイ州ロックフォード) を使用してビオチン化しました。 トリプシン処理 NGF 由来ペプチドに対するリガンド アフィニティー精製ウサギ ポリクローナル抗体 IDTACVCVLSR は New England Peptide (Gardner, MA) から入手し、トリプシン処理 proNGF 由来ペプチド VLFSTQPPR に対するプロNGF リガンド アフィニティー精製ウサギ ポリクローナル抗体は ThermoFisher Scientific (Waltham) から入手しました。 、MA）。 抗ペプチド抗体カラムは、ジメチルピメリミデート (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific、イリノイ州ロックフォード) を使用してプロテイン G (Poros-G Applied Biosystems、マサチューセッツ州ベッドフォード) に結合した抗体 (ペプチドあたり約 1.0 mg) を用いて前述のように調製しました。架橋用。 代用マトリックス (1% 乳溶液) は、0.5 g の粉乳を 50 mL の滅菌 Milli-Q 水に溶解することによって調製し、さらに代用マトリックスで使用溶液に希釈しました。

滅菌 Milli-Q 水中の代替マトリックスを調製しました。 ヒト血清をNGFのQCとして使用し、proNGFのQCは低かった。 以前に分析された、BioIVT からのプールされたロットのヒト血清が、proNGF QC high として、および上記の proNGF QC 混合スキームで使用されました。

血清、キャリブラント、または品質管理 (QC) サンプルのアリコート 200 μL を Eppendorf LoBind ディープウェルプレートに添加し、その後 10 mM PBS 中の 0.5% BSA 650 μL で希釈しました。 10μLのビオチン化抗NGF抗体を各サンプルに添加し、プレートを密封し、4℃で一晩振盪した(550rpm)。 Dynabeads Streptavidin MyOne C1 を再懸濁し、PBS 中の 0.05% Tween 20 を使用して 1 回洗浄しました。 25μLのC1ビーズを各サンプルに添加し、振盪(1000rpm)しながら室温で45分間インキュベートした。 次に、ビーズ処理のためにサンプルをハミルトン スター上に置きました。 サンプルと再懸濁ビーズを、5 × 300 µL の移送で 0.5 mL Protein Lobind コレクション プレートに移しました (最終洗浄/移送を含む)。 各移動中、サンプルを磁気スタンド上に 4 分間放置し、上清を吸引して廃棄しました。 PBS中の0.1% CHAPS 300μLで2回連続洗浄し、10mM PBS 300μLで最終洗浄を行い、サンプルを磁気スタンド上に4分間静置し、上清を吸引して廃棄しました。 タンパク質を 5% ACN 水中の 30 mM HCl 140 μL で溶出し、5 分間混合し、磁気スタンド上で 5 分間静置し、上清を最終収集プレートに移し、1 M TRIS 35 μL で中和しました。 pH8.3。 10 μL の内部標準使用溶液を各ウェルに添加しました。 最終処理には、15 μL の 75 mM TCEP 還元溶液 (添加前に新たに調製) を加え、60 °C で約 45 分間インキュベートすることが含まれます。 プレートを約 10 分間室温まで放冷しました。 および150 mM IAA 15 μLを各サンプルウェルに添加し、暗所、室温で約35分間インキュベートしました。 最後に、100 μg/mL LysC/トリプシン溶液 10 μL を使用して、37 °C で一晩サンプル消化を実行しました。

85 µL を、以下のモジュールを備えた Ultimate 3000 (ThermoFisher Scientific) で構成される逆相ナノフロー クロマトグラフィーの前に、抗ペプチド抗体カラムを含む HPLC システムに注入して目的のトリプシンペプチドを濃縮しました。 WPS-3000RS 温度制御オートサンプラー250 μL サンプルループ。 HPG-3400RS 急速分離バイナリポンプ（マイクロポンプ）; NCS-3500RS Nano LC システム (ローディングポンプおよびナノポンプ); TCC-3200RS（抗体カラム）カラムオーブン； NCS 3500 RSC カラム オーブン。バルブ 2、3 と、Acclaim PepMap100 C18、5 µm、100 Å 300 µm id × 5 mm (60 °C) が取り付けられたトラップ カラム (Thermo µ-Precolumn Cartridge P/N 164649) を密閉します。 LC は、Thermo Fisher Easy スプレー イオン化源を備えた Thermo Quantiva Triple Quadrupole に接続されました。 分析カラムは Thermo Easy Spray PepMap C18、75 µm × 15 cm (p/n ES800) (60 °C) です。 両方のタンパク質の LC-MS/MS アッセイでモニタリングされた MRM 遷移を表 S5 に示します。

アッセイは、1% ミルク中の 0、10、20、40、80、160、320、および 640 pg/mL NGF の標準物質で校正されました (n = 2)。 QC サンプルまたは未知物質中の NGF 濃度は、検量線に適用された線形回帰分析 (重み付け: 1/ × 2) を使用して、TraceFinder 4.1 General Quan で逆計算されました。 tNGF 分析の精度と精度は、QC1 (0.5 × 内因性)、QC2 (内因性 tNGF レベル、スパイクなし)、QC3 (内因性 + 45 pg/mL NGF)、および QC4 を使用して、4 つのレベルで 3 つの異なる日に 6 回の反復でテストされました。 (内因性 + 450 pg/mL NGF)。 QC3 および QC4 の安定性評価は、-70 °C での 1 凍結融解サイクルにわたって行われました (n = 6)。 QC3 および QC4 のレベルで室温で 4 時間 (n = 6)。

妊娠コホート実行の分析的評価の場合。 各キャリブレーション標準の 4 つの複製を 2 つの 96 ウェル プレートと QC2 レベルの品質管理サンプルに分散しました。 QC3 と QC4 は、各レベルの n が 8 になるように両方のプレートに分割されました (各プレートの n は 4)。

校正標準の使用を含まない、proNGF の相対定量アプローチが使用されました。 代わりに、proNGF が高い (proQCH) および低い (proQCL) ヒト血清を大量に測定するための広告混合スキームが考案されました。 proQCL には Millipore-Sigma 血清を使用し、proQCH は、高い proNGF レベルを持つと別途測定された BioIVT 血清ロットを組み合わせて作成しました。 3 つの中間 QC レベルは、proQCL と proQCH を異なる比率で混合することによって作成されました。proQCM1: 75% proQCL と 25% proQCH。 proQCM2 50% proQCL および 50% proQCH; proQCM3 proQCL 25%、proQCH 75%。 proNGF 測定は、軽ペプチドのシグナル領域と重ペプチド (安定同位体標識) のシグナル領域の比を確立することによって実行されました。

この研究には、3 学期にわたってサンプルを提供した妊娠女性を含む 4 つのコホートがありました (グループ I: 妊娠第 1 週、1 ～ 13 週、n = 24; グループ II: 妊娠第 2 週、14 ～ 26 週、n = 28; グループ III: 3 番目) 3 学期、27 ～ 40 週目、n = 22)、各学期の中間点付近で採取したサンプルと対照サンプル (グループ IV: 非妊娠、n = 29)。 対照の非妊娠コホートは、妊娠コホートとできるだけ一致するように選択されました。 妊娠コホートのメンバーは18歳以上の白人で、HCG検査および/または超音波検査によって妊娠が確認されています。 サンプルは、妊娠の各段階にある別々の女性コホートから採取されます。 違法薬物の使用歴、HIV、ジカ熱、血液由来の性感染症、鎌状赤血球貧血、または研究に生理学的に影響を与える可能性のあるその他の既知の疾患を含む現在の感染症を患っている場合、被験者は除外されました。 B/C型肝炎、HIV-1、HIV-2、梅毒、結核の過去の感染も除外されました。 生命の誕生、単胎または双生児などの妊娠の結果に関する情報は入手できませんでした。 血清は、WCG 治験審査委員会から倫理承認を得て、Cureline, Inc. (米国カリフォルニア州ブリスベン) によって収集されました (WCG IRB Reference No.: 20140236; Cureline Study No. 1144700)。 この治験審査委員会は、米国食品医薬品局 (FDA) の規制、米国保健福祉省 (HHS) の規制、国際調和会議 (ICH) のガイドラインに基づいて定義されている適正臨床慣行に完全に準拠しています。 参加者は、サンプルを生物医学研究に使用できることについて書面によるインフォームドコンセントを提出しました。 すべての分析方法は、関連するファイザーのガイドラインおよびベストプラクティスに従って実行されました。

血清健康被験者における tNGF 濃度は、変動係数が約 30% であることが以前に測定されています55。 したがって、この研究は、2 つのグループ間の tNGF 濃度の 25 ～ 30% の差を検出するように設計され、検出力が強化されました。80% の検出力で 1 グループあたり約 20 ～ 25 のサンプル サイズが必要です。 第 2 学期と第 3 学期を第 1 学期と比較するために統計分析が行われ、学期全体および 4 つのグループすべての線形傾向も比較されました。 対数変換を tNGF に適用して、統計分析の前にグループ間の変動を安定させました。 妊娠の影響は一元配置分散分析 (ANOVA) モデルで分析されました。 潜在的な共変量が検査され、それらが tNGF または proNGF と有意に関連しているかどうかが調整されました。 異なる妊娠期間と非妊娠女性との比較、および妊娠期間全体にわたる線形傾向を、ANOVA モデルでのコントラストを使用してテストしました。 多重比較のための調整は必要なく、p 値が 0.05 未満の場合に統計的有意性が達成されました (図 3 を参照)。 すべての分析は R 3.5.0 で実行されました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究はファイザー社の後援を受け、Cureline Inc. が分析用の妊娠サンプルのコホートを提供しました。

Pfizer Inc.、1 Burtt Road、アンドーバー、MA、01810、米国

ジェイソン・ウォルシュ、ジョー・パランドラ、ヘンドリック・ノイバート

Pfizer Inc.、1 Portland St、Cambridge、MA、02139、米国

エドゥワード・ゴイバーグ

Pfizer Inc.、10777 Science Center Drive、サンディエゴ、CA、92121、米国

デン・シビン

Pfizer Inc.、445 Eastern Point Road、Groton、CT、06340、米国

スーザン・ハースト

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研究デザインとコンセプト: JW、JP、HN、SH 実施したアッセイとその他の研究: JW、JP、EG データ分析と解釈: JW、JP、HN、SH、SD 原稿草稿: すべての著者。 原稿内容のレビューと修正: すべての著者。

ジェイソン・ウォルシュへの手紙。

著者らは、以下の競合する経済的利益を宣言します: すべての著者は、これらの研究が実施された時点で、ファイザー社の従業員でした。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Walsh, J.、Palandra, J.、Goihberg, E. et al. 免疫親和性液体クロマトグラフィータンデム質量分析によるヒト妊娠中のβ神経成長因子とその前駆体の分析。 Sci Rep 13、9180 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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受信日: 2022 年 12 月 14 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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