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May 12, 2023

質量分析によるオリゴヌクレオチドマッピングにより、SARS に対する mRNA ワクチンの包括的な一次構造特性評価が可能になります。

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9038 (2023) この記事を引用

364 アクセス

55 オルトメトリック

メトリクスの詳細

タンデム質量分析計と組み合わせた UV 検出を備えた液体クロマトグラフィー (LC-UV-MS/MS) によるオリゴヌクレオチド マッピングは、SARS-CoV-2 ウイルスに対して免疫を与える世界初の商用 mRNA ワクチンである Comirnaty の開発を支援するために最近開発されました。 治療用タンパク質モダリティのペプチド マッピングと同様に、ここで説明するオリゴヌクレオチド マッピングは、酵素消化、正確な質量測定、および最適化された衝突誘発断片化を通じて、mRNA の直接的な一次構造の特徴付けを提供します。 オリゴヌクレオチドマッピングのためのサンプル前処理は、ワンポット、1 酵素による迅速な消化です。 消化物は拡張勾配を使用した LC-MS/MS によって分析され、結果のデータ分析には半自動ソフトウェアが使用されます。 単一のメソッドでは、オリゴヌクレオチド マッピングの読み出しには、最大配列カバー率 100% の再現性が高く、完全にアノテーションが付けられた UV クロマトグラムと、5' 末端キャッピングおよび 3' 末端ポリ (A) テールの長さの微小不均一性評価が含まれます。 オリゴヌクレオチドマッピングは、構築物の同一性と一次構造の確認、製造プロセス変更後の製品の比較可能性の評価を提供することにより、mRNA ワクチンの品質、安全性、有効性を確保するために極めて重要でした。 より広範には、この技術は一般に RNA 分子の一次構造を直接調べるために使用できます。

2 つのメッセンジャー RNA (mRNA) ワクチン、ファイザー・ビオンテック社の Comirnaty とモデルナ社の Spikevax が、2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) のパンデミックと戦うために、FDA、EMA、およびその他の世界中の規制当局によって承認されました1,2。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）感染によって引き起こされます3。 mRNA ワクチンには、標的免疫原性タンパク質の自己翻訳のための遺伝的指示が含まれているため、免疫化に使用できます4。 承認された COVID-19 ワクチンの mRNA は S-2P タンパク質をコードしています5。このタンパク質は、融合前立体構造を引き起こす 2 つの安定化プロリン変異によって SARS-CoV-2 スパイクタンパク質とは異なります6。mRNA 原薬（DS）は、インビトロ転写によって製造されます（ IVT) N1-メチルシュードウリジンを含むバクテリオファージ T7 ポリメラーゼを使用して、ヌクレオシド修飾メッセンジャー RNA (modRNA) を形成します。 その後、modRNA DS は細胞への送達と分解力からの保護のために脂質ナノ粒子 (LNP) でカプセル化されます。 製剤化された modRNA-LNP は、ワクチン接種のために投与される医薬品 (DP) を構成します。

製薬会社には、自社が販売する最終医薬品やワクチンの分子構造、配列、不均一性、不純物を特徴づけ、理解する無条件の責任があります。 mRNA DS の 5' 端から 3' 端までの一般的な一次構造は、5' キャップ、5' 非翻訳領域 (UTR)、抗原コード領域、3' UTR、および 3' ポリアデノシン テール (ポリ(A)) です。 -tail)7 一本鎖形式。 翻訳能力を発揮するには、mRNA の 5' 末端がキャップされており 8、十分な数の連続したアデノシン ヌクレオチドを備えたポリ (A) テールが必要です 9。 5' キャップは、多くの場合、次のアデノシンまたはグアノシン ヌクレオチドのリボースの 5' 炭素に接続された 5' 末端 N7 メチル化グアノシン三リン酸であり、その 2' 炭素でもメトキシル化されている可能性があります10。 これらの 5' キャップおよびポリ (A) テールの属性は、mRNA を細胞分解プロセスから保護することによって安定性ももたらします 11、12。 5' キャップおよびポリ (A) テール末端を含む全長 mRNA 一次構造の完全性は、ワクチン DS の重要な品質特性を表しており、望ましい製品品質を確保するために綿密に監視されています。

過去数十年にわたって、複数のクロマトグラフィーおよび電気泳動による「オリゴヌクレオチド マッピング」技術が開発されてきました 13、14、15。 より最近では、mRNA ワクチンの 5' Cap16 の詳細な特性評価のために、質量分析と組み合わせたイオンペア逆相高速液体クロマトグラフィー (IP RP-HPLC-MS) を利用した質量分析 (MS) ベースの mRNA 特性評価方法が開発されました。および 3'-ポリ(A)-テール17。 ただし、これらは精製と各末端の特性評価のための専用の分析方法を必要とします。 最近、大型 RNA のオリゴヌクレオチド配列決定のために、タンデム MS (MS/MS) を使用または使用しない酵素消化および IP RP-HPLC を利用した追加の分析方法が開発されました 18、19、20、21、22。 さまざまな溶液中酵素 22 や磁性粒子に固定化された RNase T1 は、配列カバー率の向上について評価されています。 中山ほからは、安定同位体標識標準を使用した LC-MS ベースの mRNA プロファイリング法を開発しました。 前述した RNA の一次構造の特徴付けに関する先駆的な研究 18、19、20、21、22 にもかかわらず、包括的かつ簡単に使用できる分析方法があることはこの分野にとって有益です。 簡単な実装に適した理想的なオリゴヌクレオチド マップは、安定同位体標識を必要とせず、ワン ポット、1 つの酵素消化で 5 ' キャップおよび 3' 末端の不均一性を含む RNA 全長を直接かつ効率的に特徴付けることができるものです。コントロール。 配列異性体を解決し、最大配列範囲のマップを含む完全に注釈付きの UV クロマトグラムを生成します。

ここでは、ケーススタディとして Comirnaty を使用して、完全長 mRNA の一次構造を直接的かつ包括的に特徴付けるためのオリゴヌクレオチド マッピング方法について説明します。 当社のオリゴヌクレオチド マッピング メソッドでは、最先端のイオンペア逆相超高速液体クロマトグラフィーと UV 検出 (IP-RP-UHPLC-UV) を組み合わせた超高分解能エレクトロスプレー イオン化タンデム質量分析 (ESI MS/MS) を採用しています。リボヌクレアーゼ T1 (RNase T1) 消化によって生成されたオリゴヌクレオチド フラグメントを分離して同定します。 カスタム構築されたデータ分析ツールにより、包括的な半自動一次構造の読み出しが可能になります: (1) mRNA 一次構造の特定のフィンガープリントを表す何百もの消化産物で完全に注釈が付けられた UV クロマトグラム、(2) 独自の最大の配列カバレッジを示すカバレッジ マップ、( 3) 5' キャップおよび 3' 末端の微小不均一性の評価。

ファイザー-BioNTech の新型コロナウイルス感染症ワクチンは、2022 年 7 月現在、世界 186 の市場で発売されています23。この展開を促進するために、オリゴヌクレオチドマッピングを使用した一連の構造解明と比較可能性の研究が完了し、世界の保健当局に提出されました。 これは、ワクチンの生産能力と世界的供給を拡大するために導入された新しいDS製造拠点と生産規模の拡大により、現在のバッチと同等の製品品質のmRNAが生産されたことを実証しました。 ここで、我々のオリゴヌクレオチドマッピング法により、単一の方法で最大配列カバー率 100% で Comirnaty DS の完全な一次構造評価が容易になりました。 最適化された MS/MS フラグメンテーション パラメーターと市販ソフトウェアと組み合わせた専用ソフトウェアは、高い最大配列カバー率を得るためにオリゴヌクレオチド配列異性体を区別するのに不可欠でした。 当社の包括的な半自動オリゴヌクレオチド マッピング手法は、配列、末端形態、および潜在的な修飾の完全長 mRNA の高度な特性評価を提供するために開発されました。 これは、mRNA の一次構造の理解、比較性評価の重要な要素であり、SARS-CoV-2 変異体由来の非常に類似した mRNA 配列を区別するための直交 DS 同一性アッセイとして使用できる可能性があります。

オリゴヌクレオチド マッピングは、Comirnaty BNT162b2 Original DS (つまり、SARS-CoV-2 ウイルス、武漢-Hu-1 分離株のスパイク糖タンパク質 (S) をコードするオリジナルの Pfizer-BioNTech COVID-19 ワクチン) の代表的なバッチを使用して開発されました。 : GenBank: QHD43416.1)、その後の Comirnaty BNT162b2 コンストラクト (BNT162b2s04 デルタおよび BNT162b2s05 [Omicron]) および他のポートフォリオ mRNA 分子に適用されています。 50 マイクログラムの mRNA DS を、20 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む 50 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (Tris) pH 7.5 緩衝液中、2500 U の RNase T1 で 37 °C で 90 分間消化しました。 得られた酵素フラグメント溶液に、10×トリエチルアミン (TEA) および 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP) エマルジョンを添加して、最終 v/v 濃度が 0.1% TEA 1% となるようにしました。 HFIP。 4 µg のロードを注入し、1290 Infinity II Bio LC システム (Agilent) と ACQUITY Premier Oligonucleot を組み合わせた 260 nm での UV 検出を備えたイオンペア逆相超高速液体クロマトグラフィー (IP RP-UHPLC) によってフラグメントを分離しました。 C18 カラム: 130 Å、1.7 μm、2.1 × 150 mm (Waters)。 各移動相には 0.1% TEA と 1% HFIP が含まれていました。 TEA はイオン対形成剤として機能し、HFIP は揮発性の弱酸として MS と互換性のある緩衝作用を提供します。 勾配は 195 分で 1 ～ 17% 移動相 B (50% メタノール)、次に 60 分で 17 ～ 35% B に進行し、続いて洗浄および平衡化セグメントが続きました。 流速はポストカラムスプリットで 0.2 mL/min、UV ダイオードアレイ検出器へは 50 µL/min、Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific) へは 150 µL/min でした。 オンライン エレクトロスプレー イオン化 (ESI) MS 取得は、スプレー電圧 2700 V のマイナス イオン モードで実行されました。MS スキャンは、400 m/z で 120,000 の分解能 (RP) で 400 ～ 2000 m/z でした。 タンデム質量分析 (MS/MS) は、データ依存取得 (DDA) アルゴリズムによって選択された多価前駆体候補の 17、21、25 段階の高エネルギー衝突解離 (HCD) によって 30,000 RP で実行されました。

BioPharma Finder バージョン 5.0 ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用して、理論上の RNase T1 消化産物に対する MS および MS/MS の両方の一致に基づいてオリゴヌクレオチドを同定しました。 MS マッチには、観察されたオリゴヌクレオチドの中性質量が理論質量の 5 ppm 以内であることが必要でした。 MS/MS の一致には、すべての主要なフラグメントが同定され、5' または 3' 末端を含むフラグメント イオン (内部フラグメントではない) から完全な配列が推定できることが必要でした。 自動化ソフトウェアが厳密な MS/MS マッチングを採用していることを確認するために、ソフトウェアは、mRNA 分子と同じヌクレオチド組成のランダムな配置を持つデコイ構築物の理論上の RNase T1 消化物に対して LC-MS/MS データセット全体を検索しました。 自動化されたソフトウェア識別リストを強化するために、Excel Visual Basic for Applications (VBA) スクリプトを使用して、未識別の LC-UV 特徴と基礎となる質量スペクトルを 1 つずつ調べました。 Protein Metrics Byos ソフトウェアを使用して、73 mer R1062 およびその関連ポリ (A) テール種を含む 5' または 3' 末端を特徴付けました。 5' または 3' の同定は、MS/MS を使用せずにデコンボリューションしたゼロ電荷質量スペクトルを使用して行われました。

詳細な段階的な方法は、サンプルの酵素処理、分離、UHPLC-UV によるオリゴヌクレオチドの検出、および高分解能質量分析によるオリゴヌクレオチドの同定を説明する補足データ文書として提供されます。 また、複数の Excel VBA ツール、BioPharma Finder ソフトウェア、および Protein Metrics Byos を使用して、mRNA 消化の高度な特性評価を達成する方法についても説明します。

ワクチンや治療薬向けの mRNA の一次構造は、規制当局によって重要な品質特性とみなされており、品質、安全性、有効性を確保するには完全性を経験的に確認する必要があります。 理想的な一次構造特性評価技術は、mRNA 分子の直接測定により、全長 mRNA 配列、5' および 3' 末端、および部位特異的修飾を明確に解明します。

IP RP-HPLC-UV-MS および MS/MS を組み合わせて、RNase T1 消化によって生成されたすべてのオリゴヌクレオチドを分離および同定することにより、Comirnaty BNT162b2 Original mRNA の一次構造を直接特徴付ける単一酵素オリゴヌクレオチド マッピング法が開発されました。 これにより、388 個のオリゴヌクレオチドの検出が可能になりました。 これらのオリゴヌクレオチドのうち 74 個は、構築物内に複数回出現します。これらは、異なる開始位置 (遺伝子座) を持つ配列モチーフの繰り返しです。 このように観察されたオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｔ１消化時の構築物中の各遺伝子座に由来する場合、ＢＮＴ１６２ｂ２内の理論上の４２８３個のヌクレオチドすべてがこの方法によってサンプリングされたことになる。 したがって、この方法で達成できる最大配列カバレッジは 100% でした。 他の 314 個のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、構築物内の単一の遺伝子座に由来します。 それらの起源にはあいまいさはありません。それらは 2380 ヌクレオチドを占め、55.6% の固有の配列カバー率を示します。 長いポリ (A) テール オリゴヌクレオチドを除いて、すべてのオリゴヌクレオチドは MS/MS フラグメンテーション スペクトル マッチングによって同定されました。

RNA の RNase T1 消化により、各グアノシン ヌクレオチドの 3' 側のホスホジエステル主鎖が切断され、3' 末端グアノシン リボースの 3' 炭素にリン酸が残ります。 したがって、RNase T1 消化産物の 5' 末端ヌクレオチド リボースの 5' 炭素にはリン酸は存在しません。 切断ミスによる消化産物は、1 つ以上の内部 (非 3' 末端) グアノシン ヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドです。 BNT162b2 の理論上の RNase T1 消化により、コンストラクト内の配列モチーフの反復により 302 個の固有のオリゴヌクレオチドにグループ化される 1062 個のオリゴヌクレオチドが作成されます。 この研究で特定された 388 個のオリゴヌクレオチドのうち、302 個は RNase T1 の理論上の消化産物です。 他の 86 個のオリゴヌクレオチドには、23 個の追加のポリ (A) テール、49 個の欠落切断、および 14 個の非特異的切断オリゴヌクレオチドが含まれます (補足データ表 1)。

オリゴヌクレオチドマッピングの最初の読み取りは、RNase T1 消化産物の完全に注釈付きの UV クロマトグラム (図 1A) です。これは、MS によって同定された各オリゴヌクレオチドの保持時間を対応する UV ピークと照合することによって生成されます。 一般に、この方法ではヌクレオチド残基の数によって種を分離し、短いオリゴヌクレオチドが長いオリゴヌクレオチドの前に溶出します。 主要な定常逆相-分析物相互作用は、トリエチルアンモニウム-ホスホジエステル主鎖イオンペアとの相互作用です。 オリゴヌクレオチドの長さのサブセットごとに、溶出順序は核酸塩基の組成と配列によって影響されます。 特に、5' 末端ヌクレオチドはこの順序に影響を与えます。 同じ長さのオリゴヌクレオチドの場合、溶出順序は最初に C、次に V、次に A となる傾向があります (V は N1-メチルプソイドウリジンを表します。補足データ図 1)。

BNT162b2 オリジナル DS の RNase T1 オリゴヌクレオチド マップ。 (A) BNT162b2 オリジナル DS の IP RP-UHPLC-UV-MS/MS RNase T1 オリゴヌクレオチド マップ、14 ～ 254 分。 「R」は、5' 末端から 3' 末端に向かってインデックス付けされたオリゴヌクレオチド RNase T1 消化産物を表します。 「*」は配列反復オリゴヌクレオチドを示し、単一のピークの割り当ては配列内のすべての同一のオリゴヌクレオチドを表します。 各色は、消化産物ごとのヌクレオチドの数を区別します。青: 4、10、および 16。 緑: 5 と 11。 ゴールド: 6 と 12。 赤: 7 と 13、紫: 8 と 14、黒: 9 と 15、マゼンタ: > 16。グラフをわかりやすくするために、観察されたすべてのオリゴヌクレオチドがクロマトグラムに注釈されているわけではありません。 完全なリストは補足データ表 1 にあります。(B) BNT162b2 オリジナル DS の IP RP-UHPLC/UV/MS/MS RNase T1 オリゴヌクレオチド マップ、0 ～ 20 分。 「R」は、5' 末端から 3' 末端に向かってインデックス付けされたオリゴヌクレオチド RNase T1 消化産物を表します。 「*」は配列反復オリゴヌクレオチドを示し、単一のピークの割り当ては配列内のすべての同一のオリゴヌクレオチドを表します。 各色は、消化産物ごとのヌクレオチドの数を区別します。赤: 1。 紫: 2; 黒: 3; 青: 4; 緑: 5. グラフをわかりやすくするために、観察されたすべてのオリゴヌクレオチドがクロマトグラムに注釈されているわけではありません。 完全なリストは補足データ表 1 にあります。(C) 55.6% の固有配列カバー率は、観察された 314 個の固有配列オリゴヌクレオチドに基づいて、青と緑の網掛けで示されています。 青色のヌクレオチドは、固有の配列の RNase T1 オリゴヌクレオチドを構成します。 緑色のヌクレオチドは、ユニークな配列の切断されていないオリゴヌクレオチドと断片オリゴヌクレオチドを含みます。 緑色と白色のヌクレオチドには、観察された 74 個の反復配列オリゴヌクレオチドに基づく反復配列 RNase T1 オリゴヌクレオチドも含まれます。 「V」はN1-メチルプソイドウリジンです。

配列モチーフの繰り返しのため、オリゴ マップの一部の特徴は複数の消化座位に由来します。 例えば、15.8分で溶出する「AAAG」消化産物は、配列内のその遺伝子座の1つまたは最大4つすべてに由来する配列反復オリゴヌクレオチドである。 BNT162b2 コンストラクトの最初の AAAG 遺伝子座はヌクレオチド残基 514 ～ 517 にあります。 これは、5'末端から数えて118番目のGに続くため、「R119」オリゴヌクレオチドと呼ばれます。 このオリゴヌクレオチド 4 量体には 4 つの UV 260 nm 発色団があり、その LC/UV ピーク面積は 2.88 × 105 です (補足データ表 1)。 他のオリゴヌクレオチドはこの種と共溶出しません。 配列 ACCCCVCCVAVCAAG を持つ 15 mer R606 は 205 分で溶出し、共溶出種はなく、ピーク面積は 2.55 × 105 です。ピーク面積と発色団の化学量論の類似性により、16 分の AAAG の特徴は次のとおりであると結論付けるのが妥当です。 4 つすべての RNase T1 AAAG オリゴヌクレオチド消化産物 (R119、R731、R914、および R1046) で構成されます。 すべてのピークの観察された LC / UV ピーク面積を、オリゴヌクレオチドの割り当てを考慮した予測 (理論的) ピーク面積と比較し、配列反復オリゴヌクレオチドで構成される LC-UV ピークがそのすべての遺伝子座からの寄与があることを示しました (補足データ図 2)。 。 したがって、BNT162b2 のオリゴヌクレオチド マッピングは、可能な最大配列カバー率 100% を達成しました。

図 1 のオリゴヌクレオチド マップ クロマトグラムを簡略化するために、反復配列には最初の遺伝子座インスタンスにアスタリスクの接尾辞が付けられています。 したがって、16 分の特集は「R119*」です。 ほとんどの「*」ピークは小さなオリゴヌクレオチドです: 1 量体 (G)、2 ​​量体 (AG、CG、VG)、3 量体 (AAG など)。 最大のものは 8 量体の VACAVCVG で、2 つの部位 (R566 と R947) に存在します。 これらの反復配列は、BNT162b2 構築物の重要な部分を構成します。 初期の UV クロマトグラム (図 1A および B) は、反復配列を表すピークが、各種の遺伝子座の数に比例する重要なピーク面積を持っていることを示しています (補足データ表 1)。

切断ミスは低レベルで検出されますが、これらの豊富な反復配列は、RNase T1 消化が 90 分でほぼ完了していることを示しています。 LC-MS/MS24 によるペプチドマッピングを実行する場合の非固有ペプチドの従来の処理と同様に、最大配列範囲の決定では非固有オリゴヌクレオチドの各遺伝子座が考慮されます。 これは、観測された UV ピーク面積と予測された UV ピーク面積の間の相関関係を考慮すると、これも保証されます (補足データ図 2)。

オリゴヌクレオチド マッピングの 2 番目の読み取りは、検出された各ヌクレオチドの固有の配列範囲マップです (図 1C)。 遺伝子座を 1 つだけ持つオリゴヌクレオチドのサブセットを考慮すると、固有の配列カバー率は 55.5% でした。 すべての理論上の RNase T1 消化の固有配列オリゴヌクレオチドが観察されました。

臨床および商業的な製造プロセスの変更（場所、規模など）は、mRNA ワクチン生産中に一般的であり、分析技術は変更前と変更後のバッチの製品の比較可能性を証明する必要があります 25。 オリゴヌクレオチド マッピングにより、複数の mRNA DS バッチにわたる mRNA 一次構造の比較性を直接、詳細に評価できます。 これは、治療用タンパク質バッチの比較性評価に LC-UV-MS/MS によるペプチド マッピングを適用することに似ています 26。 全長クロマトグラムの重ね合わせおよびクロマトグラムのズームセグメントの重ね合わせによって実証されるように、3つの市販BNT162b2バッチのmRNA一次構造は同等であると考えられました（図2A）（補足データ図3）。

オリゴヌクレオチドマッピングによりアッセイされたバッチ比較性および構築物の同一性。 (A) 3 つの GMP 製造 BNT162b2 Original DS バッチをオリゴヌクレオチド マッピングによって評価しました。 得られた UV クロマトグラムは視覚的に比較可能であり、プロセスの一貫性を示しています。 補足データ 図 3 は、これらのデータを 6 セグメントに拡大したものです。 バッチ 3 は小規模で作成されました。 バッチ 1 と 2 は同じ GMP プロセスによって製造されました。 (B) BNT162b2 Original、BNT162b2 Delta、および BNT162b2 Omicron mRNA DS の部分オリゴヌクレオチド マップ。 黒で示した RNase T1 ダイジェスト オリゴヌクレオチド配列は、3 つのバリアント コンストラクトすべてに共有されています。 青色の配列は、BNT162b2 Original コンストラクトと BNT162b2 Delta コンストラクトによって共有されます。 緑色はBNT162b2 OriginalとBNT162b2 Omicronコンストラクトで共有されます。 オレンジ色と赤色のオリゴヌクレオチドは、それぞれ BNT162b2 Delta と BNT162b2 Omicron コンストラクトに固有です。 (C) BNT162b2 Original の 2 つのバッチを重ね合わせたもの (上のペイン)、および BNT162b2 Delta を重ねた 1 つの BNT162b2 Original バッチ (下のペイン) の部分オリゴヌクレオチド マップ。 BNT162b2 オリジナルと BNT162b2 デルタ構築物のクロマトグラム間の差異には、差異を説明するオリゴヌクレオチドの注釈が付けられています。 青色のオリゴヌクレオチドは、BNT162b2 Original および BNT162b2 Delta コンストラクトによって共有されます。 オレンジ色のオリゴヌクレオチドは、BNT162b2 Delta コンストラクトに固有です。 括弧内の数字は、各コンストラクト シーケンス内のシーケンスの繰り返し数をカウントします。赤は BNT162b2 デルタ コンストラクトの出現数を示し、黒は BNT162b2 オリジナル コンストラクトの出現数を示します。

同様の比較分析では、オリゴヌクレオチド マッピングにより、mRNA 一次構造の独特で微妙な差異を特定できます。 SARS-CoV-2 デルタおよびオミクロン変異体ワクチンコンストラクト配列、BNT162b2 デルタおよび BNT162b2 オミクロンは、補足データ図 4 に示すように、BNT162b2 オリジナルと 99.6% および 98.6% 類似しています。 3 つすべてのコンストラクトの mRNA 一次構造は、明確なピークを示しました。オリゴヌクレオチドマッピングによるプロファイルの違い (図 2B)、3 つのうちの少なくとも 1 つに存在するオリゴヌクレオチドまたは存在しないオリゴヌクレオチドによるもの。 それらのコンストラクトに固有の 2 つのオリジナル オリゴヌクレオチド、1 つのデルタ オリゴヌクレオチド、およびコンストラクトに固有の 15 個のオミクロン オリゴヌクレオチドのうち、16 個は、予想された方法で UV および抽出イオン クロマトグラム分析によって明確に区別されました (2 つのコンストラクト マップには存在せず、1 つは存在します。補足データ図。 5)。 18 人中 17 人は明確な MS/MS を示しました。 Omicron 独自の 4 mer VCAG のみが配列異性体と共溶出し、確実な MS/MS 同定が妨げられました。

オリゴヌクレオチドのマッピングにより、これらの変異体構築物間の一次構造の微妙な違いも明らかになります。 16 ～ 30 分のクロマトグラフィー ウィンドウで、BNT162b2 オリジナル BNT162b2 デルタ オリゴヌクレオチド間に 3 つの顕著な違いが観察されます (図 2C)。 最初の違いは、19 分のデルタ UV ピークの前肩が高くなっている点です。 これは、BNT162b2 デルタマップでは同定されるが、BNT162b2 オリジナルマップでは同定されないオリゴヌクレオチド CCVVG によって説明されます。 これは、BNT162b2 デルタ配列のみからの予想される RNase T1 消化産物であり、BNT162b2 オリジナル配列と BNT162b2 デルタ配列の間の 1 つの相違点を表します。 VVCCG として識別される 21.8 分の UV ピークは、BNT162b2 Delta クロマトグラムでは BNT162b2 Original クロマトグラムよりも少ないです。 これは、BNT162b2 オリジナル配列に 2 つの遺伝子座、BNT162b2 デルタ配列に 1 つの遺伝子座を持つ配列反復オリゴヌクレオチドであるために発生します。 逆に、ACCAGとして識別される27.0分のUVピークは、このオリゴヌクレオチドが前者の配列の5つの遺伝子座と後者の配列の4つの遺伝子座に由来するため、BNT162b2 Originalと比較してDeltaでより豊富です。

重要なことに、この 16 ～ 30 分のクロマトグラフィー ウィンドウでは他の違いは明らかではなく (図 2C)、これは予想される RNase T1 消化オリゴヌクレオチドの理論的な表と一致しています。 これらの変異体のクロマトグラム間の正確な重複は、それらが単一のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットの同じ化学量論的数を有することを示しています。 さらに、オリゴヌクレオチドマッピングによるBNT162b2オリジナル対デルタの比較分析は、バッチ間比較の重要な視覚的対比を提供し、重ね合わせによる視覚的比較可能性の主張が適切である。

5' 末端の適切なキャッピングとポリ(A) 3' 末端の適切な長さは、mRNA ワクチンまたは治療薬にとって重要な品質特性です。 ここで開発されたオリゴヌクレオチド マップにより、どちらの末端の単離や精製も必要とせず、単一の技術で 5' キャップと 3' ポリ (A) テールの直接特性評価が可能になります (図 3)。 5'末端の抽出イオンクロマトグラム（図3A）および付随する逆畳み込み質量スペクトルは、適切にキャップされた形態（図3AおよびBに示す5'ppp-AG）と比較して、微量レベルのキャップされていない種（図3AおよびBに示す5'ppp-AG）の明確な検出を示しています。高分解能精密質量を使用した、BNT162b2 Original、Delta、および Omicron の 5' キャップ-AG（図 3A および C）に示されています。 5' 末端の大部分は各構築物で適切にキャップされています (これは直交 LC-UV ベースの分析によって確認されました - データは示されていません)。

mRNA のオリゴヌクレオチド マッピングにより、アフィニティー精製を行わずに 5' 末端と 3' 末端の同時特性評価が可能になります。 (A) BNT162b2 の 5' 末端オリゴヌクレオチドのキャップなし (5'ppp-AG) およびキャップ付き (5' キャップ-AG) バージョンの抽出イオンクロマトグラム ([M-1H]1-、[M-2H]2-)バリアントは、オリジナル、デルタ、およびオミクロンを構成します。 (B、C) BNT162b2 変異体コンストラクト、オリジナル、デルタ、およびオミクロンの 5' 末端オリゴヌクレオチドの、それぞれキャップなし (5' ppp-AG) およびキャップ付き (5' キャップ-AG) バージョンのデコンボリューションされたゼロ電荷質量スペクトル。 スペクトルは、Byos v4.4 (Protein Metrics) を使用して、パネル A で強調表示されている領域内のスキャンの合計からデコンボリューションされます。 観測された質量 (モノアイソトピック) は理論上の質量と 3 ppm 以内で一致しており、これは Orbitrap 質量分析計の精度と精度と一致しています。 (D) BNT162b2 バリアント構築物のポリ (A) テール領域の UV クロマトグラム (260 nm) オリジナル、デルタ、およびオミクロン: 一般式 C[A]nG からなる A30 および L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチド領域ACV[A]n にはそれに応じてラベルが付けられます。 クロマトグラフィーで分離された A30 ポリ (A) ピークは、各オリゴヌクレオチドで検出されたアデノシンの数に従って標識されます。 アスタリスク (*) は、A30 ポリ (A) オリゴヌクレオチドの切断ミスから生じる別の A30 ポリ (A) オリゴヌクレオチド分布を示し、一般式 CCACACCCVGGAGCVAGC[A]nG で構成されます。 青いボックスは、パネル (E および F) でさらに説明されている L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチド (未分離) のクロマトグラフィー分布を強調表示しています。 (E) パネル (D) で強調表示されている青いボックス領域内のスキャンの合計からの L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチド分布のデコンボリューションされたゼロ電荷質量スペクトル。 質量スペクトルのピークは、各 L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチドで検出されたアデノシンの数に従って標識されます。 二重アスタリスク (**) は、サンプル調製中の L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチドの人為的分解から生じる個別の L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチド分布を示します。 観測された質量 (モノアイソトピック) は理論上の質量と 5 ppm 以内で一致しており、Orbitrap 質量分析計の精度と精度と一致しています。 脱同位体化による約 1 および 2 Da の質量誤差は、これらの種の微量レベルの相対存在量または他の種からの信号干渉により、L70 ポリ (A) 分布の特定の種で発生しました。 より具体的には、不十分な信号対雑音比または干渉により、非統計的な同位体分布が生じ、単同位体質量測定の誤差につながります。 (F) パネル (E) で強調表示されている BNT162b2 元の L70 ポリ (A) オリゴヌクレオチド分布の抽出されたデコンボリューション クロマトグラム (XDC)。 パネル (E) の各オリゴヌクレオチドの色付きの陰影は、その XDC に対応します。

BNT162b2 Original、A30L70 の DNA プラスミドテンプレートにコードされたポリ (A) テールは、30 個のアデノシン残基 (A30 セグメント) と、その後に続く 10 ヌクレオチドのリンカー配列および追加の 70 個の連続したアデノシン残基 (L70 セグメント) で構成されます。 IVT T7 ポリメラーゼの転写ずれにより 27、複数のポリ (A) テール種が観察されます。 A30 ポリ (A) 分布は、オリゴヌクレオチド マップにより単一ヌクレオチド分解能でクロマトグラフィーにより分離され (図 3D)、質量分析プロファイリングにより確認されます (データは示されていません)。 これは、BNT162b2 Original、Delta、および Omicron の A30 ポリ (A) セグメントの長さの大部分が 29 ～ 33 アデノシン残基の範囲内にあることを確認します。

L70 ポリ (A) セグメントの分布は、単一のブロードなクロマトグラフィー ピークとして溶出します。 オリゴヌクレオチド マップは、L70 ポリ (A) 種の分布を特徴付けるために、クロマトグラムのこのセグメント内のより大きな RNase T1 消化産物を適切に MS 検出できるように特に調整されています (図 3E)。 L70 ポリ (A) 種の観察されたモノアイソトピック質量は、予想される理論的質量との正確な質量の一致に基づいて割り当てられました。 オリゴヌクレオチドマッピングにより、BNT162b2 Original では L70 ポリ (A) セグメントの長さの大部分が 71 から 88 の範囲であることが確認されました。 BNT162b2 オリジナル L70 ポリ (A) 分布の抽出されたゼロ電荷クロマトグラムは、溶出時間の増加がポリ (A) 長の増加と相関していることを示しています (図 3F)。 したがって、L70 ポリ (A) の長さは mRNA 構築物を正確に反映しており、質量分析計でのエレクトロスプレー イオン化によって誘発される人為的な断片化ではありません。 さらに、オリゴヌクレオチドマップは、転写ずれによる L70 ポリ (A) 分布の微妙な変化を検出する感度と特異性を備えています 28: デルタおよびオミクロンの L70 ポリ (A) 分布は、BNT162b2 オリジナルよりわずかに短いです (図 3E)。

オリゴヌクレオチド マッピングでは通常、さまざまな配列長 (2 mer から 20 mer 以上) にわたって適切に識別するための完全な MS/MS フラグメント イオン ラダーが必要です。 BNT162b2 Original の RNase T1 in silico 消化によって生成された 302 個の固有のオリゴヌクレオチド配列のうち、220 個は配列異性体です。 これらは、少なくとも 1 つの他のオリゴヌクレオチドと同じ組成、したがって質量を共有し、多くは 2 つの位置間の単一のヌクレオチド交換のみが異なります。 配列異性体の同定には高品質の MS/MS スペクトルが必要です。

歴史的に、オリゴリボヌクレオチド MS/MS 断片化は、衝突誘起解離 (CID) を使用して実行されてきました 29,30。 この研究では、オリゴヌクレオチドのマッピングに最新バージョンの技術である高エネルギー衝突解離 (HCD) を使用しました。 オリゴヌクレオチドフラグメントイオンタイプに対する HCD エネルギー、オリゴヌクレオチド長、電荷状態の影響、および最適な配列カバレッジのための RNA バックボーンに沿った連続フラグメンテーションの範囲を調べるために実験研究が行われました。 一般に、フラグメンテーション パターンは複雑で、多くの場合、5' (a、b、c、d) および 3' (w、x、y、z) 末端フラグメント イオンの 4 つの主要なタイプすべてが含まれます 31。 一部の HCD スペクトルには、固有の識別塩基 (-B) が欠落しているフラグメント イオンと、複数のホスホジエステル結合切断から生じた内部フラグメントが含まれていました。 内部フラグメントは、推定上のオリゴヌクレオチドの配列を推測するのに限定的に使用され、情報を提供する末端フラグメントを分解し、干渉物質の塊を追加することによってスペクトルの品質を低下させることが観察されました。 オリゴヌクレオチドマップ全体にわたるスペクトルに対する HCD エネルギーの影響を評価するために、mRNA 構築物の配列範囲をモニタリングしました。 一連の単一エネルギー固定 HCD MS/MS 取得の中で、固定 HCD エネルギー 17、21、および 25 が最適でした (図 4A)。 これらを段階的な HCD 17、21、25 メソッドに組み合わせることにより、最も高い mRNA 構築配列範囲が得られました。

最適な HCD エネルギーと電荷密度により、適切な断片化が促進されます。 (A) HCD エネルギーの関数としてオリゴヌクレオチド マッピングによって決定された相対的な BNT162b2 の元の最大配列カバー率。 各条件から得られる最大シーケンス カバレッジは、最終的な推奨条件 (段階的な HCD 17、21、25) に正規化されます。 最大配列範囲は、100% の信頼スコア パラメーター制限を使用して、BioPharma Finder によって同定されたオリゴヌクレオチドのみに制限されました。 (B) 3 つのオリゴヌクレオチドの MS/MS スペクトルとフラグメント イオン カバレージ。HCD エネルギーとオリゴヌクレオチドの長さの関数として表示されます。 MS/MS スペクトルは、7mer、14mer、および 21mer オリゴヌクレオチドに適用される HCD エネルギー 13、21、33、および 45 を使用して生成されます。 5' (a、b、c、d)、3' (w、x、y、z) として識別されるフラグメント イオン、および内部フラグメントには、キーで定義されている色分けによって注釈が付けられます。 フラグメントイオンの識別と注釈付けは、社内で開発された Visual Basic Excel ツールを使用して実行されました。 (C) 3 つのオリゴヌクレオチドの MS/MS スペクトルとフラグメント イオン カバレージ。オリゴヌクレオチドの電荷と長さの関数として表示されます。 MS/MS スペクトルは、パネル B に示されている同じ 7mer、14mer、および 21mer オリゴヌクレオチドの低電荷状態、中電荷状態、および高電荷状態に対して単一段階エネルギー HCD 法 (17、21、25) を使用して生成されます。 5' として識別されるフラグメント イオン(a、b、c、d)、3' (w、x、y、z)、および内部フラグメントには、キーで定義されている色分けによって注釈が付けられます。 フラグメントイオンの識別と注釈付けは、社内で開発された Visual Basic Excel ツールを使用して実行されました。

これらの結果は、HCD エネルギーとオリゴヌクレオチドの長さの関数として MS/MS スペクトルで生成されるフラグメント イオンの適用範囲を調べることによって特に理解されます (図 4B)。 この例では、オリゴヌクレオチド フラグメントのイオン電荷密度はすべてのスペクトルで一定に保たれました: 電荷あたり 2.3 ヌクレオチド。 より短いオリゴヌクレオチドの質量スペクトルには、通常、HCD エネルギーに関係なく、認識可能なフラグメント イオンの全範囲が含まれていました。 HCD エネルギーは、より長いオリゴヌクレオチドに対してより大きな影響を及ぼしました。 より低いエネルギーでは、配列決定に十分なレベルの生産的なフラグメントイオンが生成されませんでした。 HCD エネルギーが増加すると、配列決定に適した 5' (a、b、c、d) および 3' (w、x、y、z) 末端フラグメント イオンが大量に増加します。 HCD エネルギーは内部フラグメント イオンの量と正の相関があるため、25 を超える HCD エネルギーは推奨されません。 より長い末端フラグメントが内部フラグメントにさらにフラグメント化されると、オリゴヌクレオチドの中央から配列の識別が失われます。 この傾向は、HCD エネルギーが増加するにつれて続き、最も短いオリゴヌクレオチドのみが残り、その一部は短い末端フラグメントになります。 HCD エネルギーが 21 であると、配列決定と内部フラグメンテーションの緩和のために、比較的豊富な末端フラグメント イオンの理想的なバランスが生成されます。

MS/MS フラグメントのイオン被覆率も、荷電状態とオリゴヌクレオチドの長さの関数として研究されました (図 4C)。 HCD エネルギーは、段階的 HCD 衝突エネルギーの推奨条件である 17、21、25 で一定に保たれます。すべてのオリゴヌクレオチドの長さについて、一般に最も低い電荷状態ではフラグメント イオンの適用範囲が最も低くなり、最も高い電荷状態では一般に最も高いフラグメント イオンが生成されます。カバレッジ。 より低い電荷状態の前駆体からのフラグメント イオンは、場合によっては、次の 2 つの主な理由により、特定の位置で追加のシーケンス カバレージを可能にする可能性があります: (1) より高い電荷状態は、より低い電荷状態よりも存在量が大幅に少ない、および/または (2) より高い電荷状態荷電フラグメントイオンは、より低い電荷フラグメントイオンと重複し、両方の同一性を混乱させます。

私たちは、オリゴヌクレオチドの電荷密度の増加が、配列決定を可能にする断片化にプラスの影響を与えることを観察しました。 例えば、7 量体の [M-4H]-4 電荷状態 (1.75 ヌクレオチド/電荷) では、豊富なフラグメント イオンと完全なフラグメント イオン カバレッジが生成されます (図 4C)。 ただし、21 mer の [M-4H]-4 電荷状態 (5.25 ヌクレオチド/電荷) では比較的弱いフラグメント イオンが生成されるため、各末端の最初の数ヌクレオチドの配列しか解析できません。 この現象は、オリゴヌクレオチドの長さが増加するにつれて最も顕著になります。 電荷密度 < ~ 2.5 のオリゴヌクレオチドの MS/MS シーケンスと段階的 HCD 17、21、25 を組み合わせると、オリゴヌクレオチド マップ全体で適切な断片化が実現しました。 幸いなことに、IP RP-UHPLC-ESI MS 条件では、より大きなオリゴヌクレオチドが後で溶出するにつれて、徐々に高い電荷状態が生成されます。 これにより、MS/MS シーケンスにとって理想的な電荷密度が維持されます。 通常、同じオリゴヌクレオチドの 2 つの異なる電荷状態を MS/MS シーケンシングすることによって付加される価値はほとんどありません。

最適な HCD 断片化により、オリゴヌクレオチド マップ内のほぼすべての配列異性体の識別に成功しました。 図 5 は、これを、困難ではあるが一般的なシナリオで示しています。 抽出されたイオンクロマトグラムには 3 つの配列異性体が示されています (図 5A)。 75 分で溶出する異性体「2」は、類似質量の他のオリゴヌクレオチドと共溶出します (図 4C)。これにより、無関係な 2 つのオリゴヌクレオチドが単離されて混合 MS/MS スペクトルが生成されるリスクが増加します。 オリゴヌクレオチド マップは、混合スペクトル (図 5B および C) の発生を最小限に抑え、フラグメント イオンの電荷状態の決定を可能にするために同位体分布をサンプリングする必要性のバランスをとる MS/MS 分離ウィンドウ (1.5 m/z) を採用しています。 配列異性体「1」と「2」は非常に類似しており、3番目と6番目のヌクレオチドが1回交換されているだけで異なります（図5C）。 したがって、それらの MS/MS スペクトルは非常に類似していますが、いくつかの重要なフラグメント イオンが各配列異性体を区別します。

適切な MS/MS フラグメンテーションと解釈は、オリゴヌクレオチド マッピングにとって重要です。 (A) 3 つのオリゴヌクレオチド配列異性体 ([M-4H]4-) の抽出イオンクロマトグラム。 (B) パネル (A) に示す配列異性体「1」および「2」([M-4H]4-) のフルスキャン質量スペクトル。 青色の陰影は、その後の MS/MS フラグメンテーションに使用される前駆体分離ウィンドウを定義します。 (C) 配列異性体「1」および「2」([M-4H]4-) に由来する MS/MS フラグメンテーション スペクトル。 (D) MS/MS スペクトルにおける配列異性体「1」および「2」([M-4H]4-) の拡大セクション。選択した 5' および 3' フラグメント イオンの注釈が付いています。 観察された 5' MS/MS フラグメント ペイン (上) の 1 番目、2 番目、および 3 番目の列は、それぞれ位置 2、3、および 6 で特定された 5' フラグメントを強調表示します。 観察された 3' MS/MS フラグメント ペイン (下) の 1 番目、2 番目、および 3 番目の列は、それぞれ位置 1、2、および 5 で特定された 3' フラグメントを強調表示します。 各パネルの「発散」ラベルは、配列異性体「1」と「2」の間の同じフラグメントイオンの質量がその位置で分岐していることを示し、その位置に異なるヌクレオチドが含まれていることを示します。 「収束」ラベルは、配列異性体「1」と「2」の間の同じフラグメントイオンの質量がその位置で収束することを示し、再びその位置に異なるヌクレオチドが含まれていることを示します。 スペクトル ピークの色分けはキーで定義されます。 フラグメントイオンを強調する各矢印の独特の色の濃淡は、パネル (E) で定義された色に対応します。 (E) 配列異性体「1」および「2」([M-4H]4-) について観察されたフラグメントイオン質量表。 独自の色付きの陰影は、各タイプの 5' フラグメント イオンとその 3' ペアを定義し、パネル (D) の陰影付きの矢印と一致します。 濃い青の陰影は、2 つの配列異性体間で位置を変更する 2 つの塩基を強調表示します。 灰色の陰影は、2 つの配列異性体を互いに区別するフラグメント イオン質量を強調表示します。

5'末端から読むと(図5DおよびE)、位置1および2で終わる末端フラグメントイオンは、各配列異性体について同一の質量を有する。 位置 3 ～ 5 で終わる末端フラグメント イオンは、各配列異性体で固有の異なる質量を持ち、位置 3 での配列の違いを示します。位置 6 で終わる末端フラグメント イオンは質量が収束し、位置 6 の配列異性体間の配列の別の違いを示します。 。

3'末端から読むと(図5DおよびE)、位置1の末端フラグメントイオンは各配列異性体について同一の質量を有する。 位置 2 ～ 4 で終わる末端フラグメント イオンは、各配列異性体に固有の質量を持ち、位置 2 の配列の違いを示します。位置 5 で終わる末端フラグメント イオンは質量が収束し、位置 5 の配列異性体間の別の違いを示します。

どちらの場合も、配列の違いを検出するには、完全なフラグメント イオン ラダーがあることが前提となります。 オリゴヌクレオチド マッピングによる MS/MS フラグメンテーションにより、ほとんどの配列異性体に対して完全な相補的なフラグメント イオン ラダーが生成され、それらの明確な同定が可能になり、オリゴヌクレオチド マッピングのパラメーターの適合性が証明されました。

オリゴヌクレオチドマッピングデータの包括的で忠実度の高い分析には、実用的な使いやすさと効率性を実現する自動化が必要です。 社内の Excel Visual Basic for Applications (VBA) スクリプトと開発中のベータ版および商用ベンダー ソフトウェアを組み合わせて、オリゴヌクレオチド マッピングのデータ分析を自動化するために使用されました。 これらのツールを組み合わせることで、完全な UV ピーク アノテーションと 100% の最大配列カバレッジを備えたオリゴヌクレオチド マッピングによる、BNT162b2 Original の包括的な一次構造の特性評価が容易になりました。

カスタム Excel VBA スクリプトは、LC-MS/MS によって識別されたオリゴヌクレオチドを対応する LC-UV 機能に自動的に関連付け、UV クロマトグラム全体に自動的に注釈を付けました (補足データ図 6 はワークフロー全体を示しています)。 同定は 2 つの方法のいずれかによって提供されました: (1) 388 個中 280 個 (72%) のオリゴヌクレオチドが BioPharma Finder (Thermo Fisher Scientific) によって同定されました、(2) 388 個中 108 個 (28%) がカスタム Excel VBA スクリプトを使用して同定されました。 このスクリプトは、次の手順によって半自動オリゴヌクレオチドの同定を容易にしました。(1) 未同定の LC-UV 特徴に関連する観察された前駆体質量が、考えられる理論上の消化オリゴヌクレオチドと照合されました。(2) 未知の経験的な MS/MS m/z ピークごとに強度座標、観察された質量、電荷状態、候補リストからの仮説オリゴヌクレオチドが MS/MS スペクトル アナライザーに入力され、(3) 注釈付きの MS/MS スペクトルと対応する配列表が自動的に生成され、(4) MS/MS仮説上のオリゴヌクレオチドの MS シーケンスの一致が分析者によって検討され、同定が確認または拒否されました。

オリゴヌクレオチド マッピング データ分析は、非常に類似した MS/MS スペクトルを持つ配列異性体が大量にあるため、課題が生じます。 また、大きな（例：約 1 + MDa）標的コンストラクトの RNase T1 消化産物の多くは、同様のサイズと組成を持つ他のコンストラクトの消化産物と同一の質量と高い配列類似性を有する可能性が高くなります。 たとえば、BNT162b2 の逆方向配列には、順方向配列と同じ数の in silico RNase T1 消化産物があります。 しかし、同じ配列を持つものはそのうちの 26% だけです (図 6A)。 ただし、99% は同じ質量を持っているため (図 6B)、高品質の MS/MS とこれらのスペクトルの高忠実度の解釈がそれらの同定と正しい構築物の同定に重要になります。

オリゴヌクレオチドマッピングワークフローの適合性評価として開発されたデコイ配列検索手法。 (A) BNT162b2 オリジナルのコンストラクトとその逆配列コンストラクトの理論上の RNase T1 消化の共通および固有のオリゴヌクレオチド フラグメントのベン図。 これは、おとり構造の一例です。 理論的な消化では、それぞれ 302 個の固有配列オリゴヌクレオチド (74%) と 78 個の共有オリゴヌクレオチド (26%) が予測されます。 (B) BNT162b2 オリジナル構築物およびその予備配列構築物の理論上の RNase T1 消化の共有質量および固有質量のオリゴヌクレオチド フラグメントのベン図。 理論的な消化では、それぞれ 147 個の固有の質量のオリゴヌクレオチドが予測されます。 これらのうち、145 個のオリゴヌクレオチド (99%) が共有されています。 (C) BNT162b2 オリジナル RNase T1 消化取得のベース ピーク イオン クロマトグラムにデコイ構築物の同定を重ね合わせたもの。 各色のバーは、BioPharma Finder 自動化ソフトウェアによってデコイ構築物の RNase T1 消化に由来するものとして識別されたオリゴヌクレオチドの特徴をマークします。 デコイ構築物は、BNT162b2 Original のヌクレオチド組成を含むランダム配列です。 共通配列溶出領域には短いオリゴヌクレオチドが含まれており、そのほとんどはあらゆるデコイ構築物および RNaseT1 消化を受けたときの真の構築物に共通です。 固有の配列の溶出領域には長いオリゴヌクレオチドが含まれており、そのほとんどは真の構築物に固有のものです。 真の構築物オリゴヌクレオチドは、自動ソフトウェアがデコイ オリゴヌクレオチドの割り当てを行うためのデコイ配列オリゴヌクレオチドと十分に類似しています。 固有の配列溶出領域内の識別情報は、単一のデコイ コンストラクトに優先的に割り当てられておらず、どのデコイ コンストラクトも真のコンストラクトではないことが実証されています。 (D) BNT162b2 オリジナル RNase T1 消化取得のベース ピーク イオン クロマトグラムにターゲットとデコイ コンストラクトの同定を重ね合わせます。 各色付きのバーは、BioPharma Finder 自動ソフトウェアによってデコイまたはターゲット構築物の RNase T1 消化に由来するものとして識別されたオリゴヌクレオチドの特徴をマークします。 ユニークな配列の溶出領域内のオリゴヌクレオチドは、BNT162b2 Original コンストラクトに属するものとしてほとんど (> 95%) 識別されます。 これにより、真の構築物の同一性が確認され、オリゴヌクレオチド マッピング ワークフローが LC-MS/MS を介してオリゴヌクレオチドを正確に識別する能力が検証されます。

この課題のため、自動化されたオリゴヌクレオチド データ分析には、包括的なスケールで実行される適合性評価が必要です。 戦略の最初のステップでは、固有の問題も示しています。 BNT162b2 オリゴヌクレオチドの自動同定は、配列をランダムにスクランブルすることによって生成されたデコイ構築物に対して実行されます (図 6C)。 「固有配列領域」で溶出するほとんどのオリゴヌクレオチドは、真のコンストラクトと 1 つ以上のデコイコンストラクトのインシリコ消化に共通する「共通配列領域」オリゴヌクレオチドとは対照的に、真のコンストラクトの RNase T1 消化を通じてのみ生成できます。 。 多くの固有のオリゴヌクレオチドは、1 つまたは複数のデコイ構築物のインシリコ RNase T1 消化オリゴヌクレオチドに類似しているため、ソフトウェアは (不正確ではありますが) 忠実に識別を割り当てます。 これは、MS 前駆体イオンの一致基準が満たされており、合理的な配列の同定をサポートする十分な MS/MS 証拠があるために発生します。 重要なことは、デコイ検索からBNT162b2構築物を除外すると(図6C)、オリゴヌクレオチドが3つすべてのデコイ構築物の同等の混合物に割り当てられることになる。 対照的に、「固有配列領域」のほとんどのオリゴヌクレオチドは、デコイ構築物と並行して検索すると、BNT162b2構築物に割り当てられ、それが真の構築物であることが明らかになります（図6D）。 この読み出しは、(1) ワンポット 1 酵素による酵素消化、(2) クロマトグラフィー分離、(3) MS/MS HCD フラグメンテーション、および (4) 半自動データ分析の組み合わせワークフローが mRNA に適していることを検証します。一次構造の特徴付け。

この研究で使用された自動ソフトウェアである BioPharma Finder は、おとり検索による全体的な忠実性チェックを可能にしますが、個々の MS/MS の一致について、最良の一致と次善の一致のランキングや、信頼度スコアから導き出される一致確率は提供しません。 個々の MS/MS 割り当てをクロスチェックするために、公的に入手可能な Pytheas ソフトウェア パッケージも使用しました 32。 この比較では、ソフトウェア間で単一フラグメントのスペクトルの一致を一致させることはできませんでした。 代わりに、同じオリゴヌクレオチドの同定の保持時間を比較しました。 Pytheas は MS/MS のみを解釈するため、保持時間は完全には一致しません。つまり、識別の保持時間は MS/MS スキャン イベント時間に基づくのに対し、BioPharma Finder はプリカーサー イオン クロマトグラムを抽出し、MS/MS 識別をプリカーサー抽出されたイオン頂点の保持時間。 それにもかかわらず、BioPharma Finder で同定された 280 個のオリゴヌクレオチドの保持時間のプロット (Pytheas、BioPharma Finder) への直線近似の 0.9997 の相関係数と 0.9993 の傾きは、両方のソフトウェアがほぼすべてのオリゴヌクレオチドの同定と一致することを証明しています (補足データ図 7)。 この分析により、重要な観察結果が得られます。LC 特徴が配列異性体で構成されていない場合、BioPharma Finder と Pytheas 自動ソフトウェアは同様にオリゴヌクレオチドを同定します。 LC フィーチャーが配列異性体の混合ピークである場合、どちらのソフトウェアもオリゴヌクレオチドをうまく識別できません (フィーチャーは未同定 (BioPharma Finder) か不適切に同定されている (Pytheas) のいずれかです)。分析者は、次のような個別のスペクトル マッチング ソフトウェアを使用して慎重にスペクトルを解釈し、同定を救出する必要があります。この調査で提供されている Excel マクロ対応スプレッドシートとして。

LC-MS/MS オリゴヌクレオチド マッピングは、SARS-CoV-2 に対する Comirnaty BNT162b2 ワクチンの mRNA 一次構造の直接的かつ包括的な特性評価を提供するために開発されました。 1 つの酵素である RNase T1 を使用するこのメソッドは、100% の最大配列カバー率と 5' および 3' 末端形態の高感度検出を達成し、それによって単一のメソッドで目的の全長分子の構造的完全性を確認しました。 mRNA 内のオリゴヌクレオチド配列の繰り返し数は RNase T1 消化後に多く見られますが、このメソッドはこれらの種を化学量論的に消化して検出し、56% のユニークな配列のカバー率を高めました。 MS/MS パラメータの体系的な評価により、消化された mRNA にもよく見られる配列異性体を確実に識別できるようになり、最大配列カバー率がさらに向上しました。 最後に、自動オリゴヌクレオチド割り当ての信頼性を確保するために、デコイ配列データ分析検索技術が開発されました。 まとめると、ここで説明する LC-MS/MS オリゴヌクレオチド マッピング方法は、(1) 強力なワンポット単一の市販ヌクレアーゼ消化方法を提供することにより、既存の方法を改善します。 (2) 最適化された HCD フラグメンテーションを使用して、配列決定に最も有益な MS/MS が確実に取得されるようにする。 (3) 自動化されたソフトウェアが MS/MS を適切に解釈することを保証するために、簡単なおとり検索適合性評価を提供します。 (4) 「フィンガープリント」複合 LC-UV クロマトグラムの適切な注釈を可能にするツールの提供、および (5) 自動ソフトウェア同定をチェックし、未知の異性体混合物ピークと配列異性体混合物のピークを同定するための MS および MS/MS スペクトル解釈ツールの提供。

自動データ分析を含む LC-MS/MS ワークフロー全体を評価するには、実際的な適合性評価をお勧めします (図 6C および D)。 このおとり探索戦略は、プロテオミクス解析におけるタンパク質推論のために長年行われてきたものと類似しています 33。 このオリゴヌクレオチド マッピング方法は「-omics」方法ではありません。 3' 末端と 5' 末端の不均一性に関係なく、DS は単一の構築物であり、数千の RNA 分子の複雑な混合物ではありません。 それにもかかわらず、同じ構築物からの配列異性体は非常に類似した断片化パターンを持つ可能性があり、多くの配列異性体が存在するため、相対スペクトル比較を通じて MS/MS 一致品質の評価を可能にするデコイ検索が適切です。302 個の BNT162b2 mRNA 理論上の RNase T1 のうち 220 個オリゴヌクレオチドを消化します。

この MS アプローチのもう 1 つの有望な側面は、RNA を直接特徴付けることにより、ホスホジエステル加水分解分解部位および不完全転写部位もカタログ化され、その後 DS 分解経路を理解するためにモニタリングできることです。 さらに、DNA プラスミドの非標的領域の転写から生じるオリゴヌクレオチドを検出することも可能です (ただし、この研究では観察されませんでした)。 最後に、このオリゴヌクレオチド マッピング方法をさらに最適化し、mRNA と脂質の付加物 34 やその他の考えられる効果を含む部位特異的修飾を特徴付けるために適用することができます。

限られた消化でRNase T1欠落切断を促進するか、MazFやRNase 418、19、35などの低頻度の基質部位を持つエンドヌクレアーゼを使用することにより、RNAマップ内の固有のオリゴヌクレオチドの数を増やすための優れた戦略は他にもあります。 ここで詳述するデータ分析方法は同様にうまく機能するはずであり、さらに、混合ピーク成分の同定はオリゴヌクレオチドの一意性とは独立した問題であるため、必要になる可能性があります（ただし、混合ピークは少なくなるはずです）。

オリゴヌクレオチド マッピングと次世代シーケンス (NGS) は、mRNA の一次構造を決定するための強力な直交特性評価方法です。 どちらの手法にも明確な利点があります。 NGS は、複数のリードで連続するヌクレオチド配列を効果的に決定することができ (補足データ図 8)、また、汚染された DNA/RNA を検出および識別することができます。 オリゴヌクレオチドマッピングは、ヌクレオチド配列、キャップ付きおよびキャップなしの 5' 末端の程度、およびポリ (A) テール領域の微小不均一性を含む mRNA 分子全体の構造的完全性を確認するために使用されます。 また、製造プロセスやサイトの変更後のバッチの比較可能性を評価する重要な機能も追加されます。 同一性アッセイとして、異なる mRNA 構築物を区別するために使用できます。 メソッド固有のコントロールを合成して維持する必要はありません (重同位体標識コントロールなど)。

ここで説明する 1.5 時間の RNase T1 消化と IP-RP-UHPLC-UV-MS/MS を含むオリゴヌクレオチド マッピング方法は、SARS-CoV-2 に対する Comirnaty BNT162b2 ワクチンの開発と商品化に使用されました。 オリゴヌクレオチドのマッピングから得られたプロセスと製品の理解は、緊急使用許可 (EUA) と生物製剤使用許可申請 (BLA) の両方の規制当局への提出をサポートし、製品の品質、安全性、有効性の全体的な評価に貢献しました。 同様に、オリゴヌクレオチドのマッピングは、新型コロナウイルス感染症のパンデミックによる重要な供給課題に対処するために生産規模が拡大し、新しい製造拠点がオンライン化されたときに、最高の製品品質が維持されていることを実証するために、多くの比較実験の一部として行われてきました。 この方法により、十分に特徴づけられた mRNA ワクチンや遺伝子治療の開発と規制当局への申請を加速し、RNA 構造の科学をより広範に進歩させることが私たちの目的です。

生データと詳細なメソッドのドキュメントは、Dryad データ プラットフォーム: https://datadryad.org/stash/share/38WoZ944MVcISX-VQpGNoaXn_4Pwe5nv_ipD707TZF8 で提供されます。

Thermo BioPharma Finder の識別を確認および拡張し、注釈付きのクロマトグラムを提供するために使用される 4 つの Excel VBA ソフトウェア マッピングおよび識別ツールが、Dryad データ プラットフォームで提供されています: https://datadryad.org/stash/share/38WoZ944MVcISX-VQpGNoaXn_4Pwe5nv_ipD707TZF8。 提供されている方法ドキュメントには、各 .xlsm ファイルの使用に関するクリックごとの手順も説明されています。

分析された mRNA 構築物はファイザーで製造されました。 この原稿では配列が提供されていますが、ここで紹介されている mRNA 材料を利用できるようにすることはできません。

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著者らは、BioNTech のパートナーである Andreas Kuhn と Julia Schlereth のサポートとコミュニケーションに感謝しています。 BioPharma Finder のオリゴヌクレオチド分析モジュールの開発への協力を許可してくださった Thermo の長年のパートナーである Jennifer Sutton に感謝します。 メソッドの最適化に貢献してくれた Taylor Dufield に感謝します。 N1-メチルプソイドウリジンの吸光係数を測定してくれた Erika Jensen と Mojgan Kouhnavard に感謝します。 最後に、このメソッドの開発と適用に際し、サポートとアドバイスをいただいたファイザーのリーダーである Jeff Ryczek 氏、Lisa Marzilli 氏、Justin Sperry 氏、Margaret Ruesch 氏に感謝します。

Brian C. Gau と Andrew W. Dawdy の著者も同様に貢献しました。

BioTherapeutics Pharmaceutical Sciences、ファイザー社、米国ミズーリ州チェスターフィールド

ブライアン・C・ガウ、アンドリュー・W・ドーディ、ハンリウ・リア・ワン、ブラッドリー・ベア、カルロス・H・カスタネダ、オルガ・V・フリーゼ、トーマス・F・ラーチ

BioTherapeutics Pharmaceutical Sciences、ファイザー社、アンドーバー、マサチューセッツ州、米国

マシュー・S・トンプソン、デビッド・J・シレッリ、ジェイソン・C・ラウズ

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AD と BG はこの研究に等しく貢献しており、通信は著者のどちらかまたは両方に宛てられる場合もあります。 著者らは、彼らの意見では、最初の 2 人の著者が共同の第一著者とみなされるべきであることを知っていただきたいと考えています。 著者全員が原稿をレビューしました。

Brian C. Gau または Andrew W. Dawdy との通信。

著者は全員ファイザーの従業員です。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Gau、BC、Dawdy、AW、Wang、HL 他質量分析によるオリゴヌクレオチドマッピングにより、SARS-CoV-2 に対する mRNA ワクチンの包括的な一次構造特性評価が可能になります。 Sci Rep 13、9038 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36193-2

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受信日: 2023 年 3 月 17 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36193-2

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