環状ヌクレオチド活性化CRISPRプロテアーゼによる抗ウイルスシグナル伝達

Natura Volume 614, pagine

Nature volume 614、pages 168–174 (2023)この記事を引用

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よく知られている DNA を標的とする Cas9 や RNA を標的とする III 型システムなどの CRISPR 防御システムは、原核生物に広く普及しています 1,2。後者は、外来 RNA の認識後の環状オリゴアデニレートの合成を通じて開始される複雑な抗ウイルス応答を調整します 3,4,5。 III 型システムに関連し、環状オリゴアデニレートに結合すると予測されるタンパク質の大きなセットの中で、CRISPR 関連 Lon プロテアーゼ (CalpL) が際立っていました。 CalpL には、Lon プロテアーゼエフェクタードメインに融合された SAVED ファミリー 7 のセンサードメインが含まれています。ただし、このエフェクターの作用機序は不明です。今回我々は、CalpLの構造と機能を報告し、この可溶性タンパク質が、同じオペロン上にコードされている他の2つのタンパク質CalpTおよびCalpSと安定な三者複合体を形成することを示す。環状テトラアデニレート (cA4) による活性化後、CalpL はオリゴマー化し、MazF ホモログ CalpT を特異的に切断し、複合体から細胞質外機能 σ 因子 CalpS を放出します。私たちのデータは、CRISPR に基づく外来核酸の検出と転写制御との間の直接的な関係を提供します。さらに、CRISPR エフェクター内の環状テトラアデニレートに結合する SAVED ドメインの存在は、環状オリゴヌクレオチドに基づくアンチファージシグナル伝達システムとの関連を明らかにしています。

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結晶構造は、アクセッションコード 7QDA、8B0R、および 8B0U で Protein Data Bank データベースに登録されています。 SAXS データとモデルは、アクセッションコード SASDQM4、SASDQN4、SASDQP4、および SASDQQ4 で小角散乱生物学データバンクに寄託されています。この研究では、次のタンパク質データバンクのエントリが使用されました: 2H27、3K1J、4ME7、4IZJ、4LUP、5ZX2、5CR2、6VM6、6SCE、および 7RWK。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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Makarova, KS、Wolf, YI & Koonin, EV CRISPR-Cas システムの分類と命名法: ここから。 CRISPR J. 1、325–336 (2018)。

記事 Google Scholar

Zhu 、 Y. 、 Klompe 、 SE 、 Vlot 、 M. 、 van der Oost 、 J. & Staals 、 RHJ メッセンジャーを撃つ: RNA を標的とする CRISPR-Cas システム。生物科学。議員 38、BSR20170788 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Kazlauskiene, M.、Kostiuk, G.、Venclovas, Č.、Tamulaitis, G. & Siksnys, V. III 型 CRISPR-Cas システムにおける環状オリゴヌクレオチドシグナル伝達経路。サイエンス 357、605–609 (2017)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Niewoehner, O. et al. タイプ III CRISPR-Cas システムは、環状オリゴアデニレートセカンドメッセンジャーを生成します。ネイチャー 548、543–548 (2017)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Rouillon, C.、Athukoralage, JS、Graham, S.、Grüschhow, S. & White, MF タイプ III CRISPR システムにおける環状オリゴアデニレート合成の制御。 eLife 7、e36734 (2018)。

記事 Google Scholar

Shmakov, SA、Makarova, KS、Wolf, YI、Severinov, KV & Koonin, EV 遺伝子近傍分析による、CRISPR-Cas システムに機能的に関連する遺伝子の系統的予測。手順国立アカデミー。科学。 USA 115、E5307–E5316 (2018)。

記事 CAS ADS Google Scholar

シャー、SA et al. 古細菌および細菌の III 型 CRISPR-cas 遺伝子カセットでコードされるアクセサリータンパク質の包括的な検索により、39 の新しい cas 遺伝子ファミリーが明らかになりました。 RNAバイオル。 16、530–542 (2019)。

記事 Google Scholar

Gasiunas, G.、Sinkunas, T. & Siksnys, V. CRISPR 媒介微生物免疫の分子機構。細胞。モル。生命科学。 71、449–465 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Sasnauskas, G. & Siksnys, V. 構造的観点から見た CRISPR の適応。カー。意見。構造体。バイオル。 65、17–25 (2020)。

記事 Google Scholar

Jiang, F. & Doudna, JA CRISPR-Cas9 の構造とメカニズム。アンヌ。 Rev.Biophys. 46、505–529 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

ジネック、M.ら。適応細菌免疫におけるプログラム可能なデュアル RNA ガイド DNA エンドヌクレアーゼ。サイエンス 337、816–821 (2012)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Athukoralage、JS & White、MF III 型 CRISPR 防御時の環状ヌクレアーゼによる環状オリゴアデニレートのシグナル伝達と制御。 RNA 27、855–867 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Jia, N.、Jones, R.、Sukenick, G. & Patel, DJ III-A 型 CRISPR-Cas Csm 複合体の複合 Csm1 手のひらポケット内のセカンドメッセンジャー cA4 形成とその放出経路。モル。セル 75、933–943.e6 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Makarova, KS、Anantharaman, V.、Grishin, NV、Koonin, EV & Aravind、L. CARF および WYL ドメイン: 原核生物の防御システムのリガンド結合調節因子。フロント。ジュネット。 5、102（2014）。

記事 Google Scholar

ラウ、RKら。バクテリオファージ免疫を媒介する環状トリヌクレオチド活性化細菌エンドヌクレアーゼの構造と機構。モル。セル 77、723–733.e6 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

リントナー、NG et al. CRISPR 関連タンパク質 Csa3 の構造は、CRISPR/Cas システムの制御についての洞察を提供します。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 405、939–955 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

マクマホン、SA et al. 環状オリゴアデニレートによって活性化される III 型 CRISPR 防御 DNA ヌクレアーゼの構造とメカニズム。ナット。共通。 11,500 (2020)。

記事 CAS ADS Google Scholar

ロストル、JT 他 Card1 ヌクレアーゼは、III 型 CRISPR 免疫中に防御を提供します。ネイチャー 590、624–629 (2021)。

記事 ADS Google Scholar

Garcia-Doval, C. et al. 環状オリゴアデニレート依存性 CRISPR リボヌクレアーゼ Csm6 の活性化および自己不活化メカニズム。ナット。共通。 1596年11月（2020年）。

記事 CAS ADS Google Scholar

Lawrence, CM、Charbonneau, A. & Gauvin, C. 環状テトラアデニレート (cA4) は CRISPR 関連転写因子 Csa3 を活性化し、プロトスペーサー獲得と crRNA 発現のフィードバック活性化を提供します。 FASEB J. 34、1–1 (2020)。

Google スカラー

Meeske, AJ、Nakandakari-Higa, S.、Marraffini, LA Cas13 誘導性の細胞休眠は、CRISPR 耐性バクテリオファージの上昇を防ぎます。 Nature 570、241–245 (2019)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Burroughs, AM、Zhang, D.、Schäffer, DE、Iyer, LM & Aravind, L. 比較ゲノム分析により、生物学的衝突、免疫、シグナル伝達におけるヌクレオチド中心のシステムの広大で新しいネットワークが明らかになりました。核酸研究所 43、10633–10654 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Lowey、B.ら。 CBASS 免疫は、CARF 関連エフェクターを使用して 3'-5'- および 2'-5'-結合環状オリゴヌクレオチドシグナルを感知し、細菌をファージ感染から保護します。セル 182、38–49.e17 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

マカロバ、KS et al. 原核生物の抗ウイルス防御における重要なセンサーであるCARFドメインスーパーファミリーの進化的および機能的分類。核酸研究所 48、8828–8847 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

PH ズワートら。 PHENIX スイートによる自動化された構造ソリューション。方法Ｍｏｌ．バイオル。 426、419–435 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、VBら。 MolProbity: 高分子結晶学の全原子構造検証。アクタクリスタログル。 D 66、12–21 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Chung, IY & Paetzel, M. ブリ腹水ウイルス VP4 プロテアーゼの結晶構造: 内部切断部位トランスアシル酵素複合体を天然の Ser/Lys ダイアド活性部位に捕捉します。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 288、13068–13081 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Krogh, A.、Larsson, B.、von Heijne, G. & Sonnhammer, ELL 隠れマルコフモデルによる膜貫通タンパク質トポロジーの予測: 完全なゲノムへの応用。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 305、567–580 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

Fatma, S.、Chakravarti, A.、Zeng, X. & Huang, RH セカンドメッセンジャーとして 3', 2'-cGAMP を使用する CdnG-Cap5 アンチファージ防御システムの分子機構。ナット。共通。 12、6381 (2021)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Jiang, K. et al. 微小管マイナス末端調節CAMSAP-カタニン複合体の形成の構造基盤。構造 26、375–382.e4 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Saha, CK、Sanches Pires, R.、Brolin, H.、Delannoy, M. & Atkinson、GC FlaG および webFlaG: 遺伝子近傍保存の分析による新しい生物学の発見。バイオインフォマティクス 37、1312–1314 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Zimmermann、L.ら。新しい HHpred サーバーを中心に完全に再実装された MPI バイオインフォマティクスツールキット。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 430、2237–2243 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Holm, L. & Rosenstrom, P. Dali サーバー: 3D での保全マッピング。核酸研究所 38、W545–W549 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Simanshu, DK、yamaguchi, Y.、Park, J.-H.、Inouye, M. & Patel, DJ 枯草菌における毒素 MazF による mRNA 認識と切断、および抗毒素 MazE によるその制御の構造基盤。モル。セル 52、447–458 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ホグレル、G. et al. 環状ヌクレオチドによって誘導されるらせん構造は、TIR 免疫エフェクターを活性化します。ネイチャー 608、808–812 (2022)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Paget, MS 細菌のシグマ因子とアンチシグマ因子: 構造、機能、分布。生体分子 5、1245–1265 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Sineva, E.、Savkina, M. & Ades, SE 細胞質外機能 (ECF) シグマ因子による遺伝子制御のテーマとバリエーション。カー。意見。微生物。 36、128–137 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Krissinel, E. & Henrick, K. 結晶状態からの高分子集合体の推論。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 372、774–797 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Schuster, CF & Bertram, R. 毒素-抗毒素システムは、原核生物の細胞運命の遍在的かつ多用途な調節因子です。 FEMS 微生物。レット。 340、73–85 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Walsh、PN & Ahmad、SS 血液凝固におけるプロテアーゼ。エッセイ生化学。 38、95–112 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Brown, MS、Ye, J.、Rawson, RB & Goldstein, JL 調節された膜内タンパク質分解: 細菌からヒトまで保存されている制御機構。セル 100、391–398 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Fei, X.、Bell, TA、Barkow, SR、Baker, TA & Sauer, RT ClpXP 認識と ssrA タグ付き基質のアンフォールディングの構造基盤。 eLife 9、e61496 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Hu, C. et al. クラスパーゼは、CRISPR RNA 誘導性の RNA 活性化プロテアーゼです。サイエンス 377、1278–1285 (2022)。

記事 CAS ADS Google Scholar

ヴァン・ベルジュー、SPB 他 gRAMP CRISPR-Cas エフェクターは、カスパーゼ様ペプチダーゼと複合体を形成した RNA エンドヌクレアーゼです。サイエンス 373、1349–1353 (2021)。

記事 ADS Google Scholar

加藤和也ほか III-E 型 CRISPR ヌクレアーゼプロテアーゼによる RNA 誘発タンパク質切断と細胞増殖停止。サイエンス 378、882–889 (2022)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Strecker, J. et al. CRISPR 関連エンドペプチダーゼによる RNA 活性化タンパク質切断。サイエンス 378、874–881 (2022)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Tunyasuvunakool、K. et al. ヒトプロテオームの高精度なタンパク質構造予測。ネイチャー 596、590–596 (2021)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Robert, X. & Gouet, P. 新しい ENDscript サーバーを使用してタンパク質構造の主要な特徴を解読します。核酸研究所 42、W320–W324 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Liu, H. & Naismith, JH 効率的なワンステップの部位特異的欠失、挿入、単一部位および複数部位のプラスミド突然変異誘発プロトコール。 BMCバイオテクノロジー。 8、91 (2008)。

記事 Google Scholar

Rouillon, C.、Athukoralage, JS、Graham, S.、Grüschow, S. & White, MF III 型 CRISPR システムの環状オリゴアデニレートシグナル伝達経路の研究。方法酵素mol。 616、191–218 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Cianci、M.ら。 P13 は、可変ビーム集束による高エネルギーと低エネルギーの位相調整のための低放射率 PETRA III リングの EMBL 高分子結晶学ビームラインです。 J.シンクロトロン放射。 24、323–332 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Kabsch, W. 回転回折パターンの自動インデックス付け。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 21、67–72 (1988)。

記事 CAS Google Scholar

Liebschner、D. et al. X 線、中性子、電子を使用した高分子構造の決定: Phenix における最近の開発。アクタクリスタログル。 D 構造体。バイオル。 75、861–877 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: 分子グラフィックス用のモデル構築ツール。アクタクリスタログル。 D 60、2126–2132 (2004)。

記事 Google Scholar

ウィリアムズ、CJ 他 MolProbity: 全原子構造の検証を改善するための、より多くのより優れた参照データ。タンパク質科学。 27、293–315 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 40、658–674 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

ブランシェット、CE et al. P12 ビームライン (PETRA III、DESY) での生体溶液 X 線散乱実験のための多用途のサンプル環境と自動化。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 48、431–443 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

マサチューセッツ州グレーワートら。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) および光散乱 (LS) デバイスを追加して、高品質の小角 X 線散乱 (SAXS) データを取得します。クリスタル 10、975 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Franke, D.、キフニー、AG、Svergun、DI 小角 X 線散乱データの自動取得と分析。 Nucl. インストラム。方法物理学。解像度 A 689、52–59 (2012)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Konarev、PV、Volkov、VV、Sokolova、AV、Koch、MHJ & Svergun、DI PRIMUS: 小角散乱データ解析用の Windows PC ベースのシステム。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 36、1277–1282 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

マナラタス-カントス、K. et al. ATSAS 3.0: 小角散乱データ解析のための機能が拡張され、新しいツールが追加されました。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 54、343–355 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Svergun, D.、Barberato, C. & Koch、MHJ CRYSOL - 原子座標から生体高分子の X 線溶液散乱を評価するプログラム。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 28、768–773 (1995)。

記事 CAS Google Scholar

Franke, D. & Svergun, DI DAMMIF、小角散乱における非経験的形状決定を迅速に行うプログラム。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 42、342–346 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

DI Svergun シミュレーテッドアニーリングを使用して、溶液散乱から生体高分子の低解像度構造を復元。生物物理学。 J. 76、2879–2886 (1999)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Volkov, VV & Dmitri, IS 小角散乱における非経験的形状決定の独自性。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 36、860–864 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Kozin, MB & Svergun, DI 高解像度と低解像度の構造モデルの自動マッチング。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 34、33–41 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

ペトウホフ、MV 他小角散乱データ解析のための ATSAS プログラムパッケージの新開発。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 45、342–350 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Milov, A.、Salikohov, K.、Shirov, M. 固体における常磁性中心空間分布のための電子スピンエコーにおけるエンドアの応用。フィジーカ・トヴェルドゴ・テラ 23、975–982 (1981)。

CAS Google スカラー

Pannier, M.、Veit, S.、Godt, A.、Jeschke, G. & Spiess, HW 電子スピン間の双極子間相互作用のデッドタイムフリー測定。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 142、331–340 (2000)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Larsen, RG & Singel, DJ 二重電子-電子共鳴スピン-エコー変調: 配向性が乱れた固体における電子スピン対分離の分光測定。Ｊ．Ｃｈｅｍ．物理学。 98、5134–5146 (1993)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Worswick, SG、Spencer, JA、Jeschke, G. & Kuprov, I. DEER データのディープニューラルネットワーク処理。科学。上級 4、eaat5218 (2018)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Fábregas Ibáñez, L.、Jeschke, G. & Stoll, S. DeerLab: 双極子電子常磁性共鳴分光法データを分析するための包括的なソフトウェアパッケージ。マグニチュードレゾン。 1、209–224 (2020)。

記事 Google Scholar

Jeschke, G.、Chechik, V.、Ionita, P.、Godt, A. DeerAnalogy2006 - パルス ELDOR データを分析するための包括的なソフトウェアパッケージ。応用マグニチュードレゾン。 30、473–498 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

ミルディタ、M.ら。 ColabFold: タンパク質のフォールディングを誰でも利用できるようにします。ナット。方法 19、679–682 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

チャ、SS 他 Lon プロテアーゼの結晶構造: 隔離された分解チャンバーへのゲート付き入口の分子構造。 EMBO J. 29、3520–3530 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Chung, IYW & Paetzel, M. ウイルスプロテアーゼ分子内アシル酵素複合体の結晶構造。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 286、12475–12482 (2011)。

レア、MC 他細菌の RadA は、RecA と相互作用して双方向の D ループ伸長を促進する DnaB 型ヘリカーゼです。ナット。共通。 8、15638 (2017)。

ゾルツィーニ、V. et al. 大腸菌 mRNA エンドヌクレアーゼ MazF の基質認識と活性制御。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 291、10950–10960 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Hagelueken, G.、Ward, R.、Naismith, JH & Schiemann, O. MtsslWizard: インシリコでのスピンラベル付けと PyMOL での距離分布の生成。応用マグニチュードレゾン。 42、377–391 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Campagne, S.、Marsh, ME、Capitani, G.、Vorholt, JA & Allain, FHT 環境誘発シグマ因子による -10 プロモーター要素の融解の構造的基礎。ナット。構造体。モル。バイオル。 21、269–276 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Lane, WJ & Darst, SA グループ IV σ 因子によるプロモーター -35 要素認識の構造的基礎。 PLoSバイオル。 4、e269 (2006)。

記事 Google Scholar

Li, L.、Fang, C.、Zhuang, N.、Wang, T. & Zhang, Y. 細菌 ECF σ 因子による転写開始の構造的基盤。ナット。共通。 10、1153 (2019)。

記事 ADS Google Scholar

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シンクロトロン MX データは、EMBL ハンブルクの PETRA III ストレージリング (DESY、ハンブルク、ドイツ) のスタッフによって操作されるビームライン P13 で収集されました。ビームラインの使用に関して支援してくれた G. Bourenkov と I. Bento に感謝します。 V. Siksnys さん、有益な議論をしていただきました。 MS 分析については S. Shirran および S. Synowsky。技術支援にはN. Brenner。ディスカッションと最初のペプチドスクリーニングには M. Drag と J. Grzmska が参加しました。 MGとJLS-B。は、ドイツのエクセレンス戦略 – EXC2151 – 390873048 に基づいて、ドイツ財団ゲマインシャフトによって資金提供されています。 MFW は、欧州研究評議会の高度な助成金 (助成金番号 101018608) および中国奨学金評議会 (HC への参照番号 202008420207) を認めています。 BEB は、BBSRC(BB/R013780/1 および BB/T017740/1) による EPR 機器への資金提供を認めます。 GH は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (助成金番号 HA6805/6-1) からの資金提供に感謝しています。

これらの著者は同様に貢献しました: Christophe Rouillon、Niels Schneberger

構造生物学研究所、ボン大学、ボン、ドイツ

クリストフ・ルイヨン、ニールス・シュネベルガー、ヨナス・モエッキング、マーティン・F・ピーター、マティアス・ガイヤー、グレゴール・ハーゲルケン

マックス・プランク行動神経生物学研究所—シーザー、ボン、ドイツ

クリストフ・ルイヨン、ヴォルフガング・ベーニク、ラインハルト・ザイフェルト

セント・アンドリュース大学生物学部、セント・アンドリュース、英国

ハオティアン・チー & マルコム F. ホワイト

臨床化学および臨床薬理学研究所、ボン大学およびボン大学病院、ボン、ドイツ

カティア・ブルーメンシュトック & ジョナサン・L・シュミット＝ブルク

欧州分子生物学研究所 (EMBL)、ハンブルク拠点、ハンブルク、ドイツ

ステファノ・ダ・ベラ & ドミトリ・スヴェルガン

EaStCHEM 化学学部、生物医学科学研究複合体、および磁気共鳴センター、セントアンドリュース大学、ノースハウ、セントアンドリュース、英国

カトリン・アッカーマン & ベラ・E・ボード

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CR と GH は研究を考案、監督し、CalpL を使用して最初のタンパク質発現と結晶化実験を実施しました。 RS と WB は最初の CalpL 構築物をクローン化しました。 NS、CR、MFW、GH は実験を計画しました。 NSは、CalpLおよびCalpTの精製を最適化し、CalpL、CalpL-cA4およびCalpL-CalpT10を結晶化し、切断アッセイ、SEC-MALSおよびDLS実験を確立および実行しました。 NS と MFP はすべての変異体構築物をクローン化しました。 GH と NS は、CalpL、CalpL–cA4、および CalpL–CalpT10 構造を解明し、改良しました。 JM と MG は SPR 実験を設計し、実行しました。 HC と MFW はリボヌクレアーゼアッセイを計画し、実施しました。 HC、NS、MFW は CalpS をクローニングおよび精製し、CalpS を含む結合および共発現実験を実施しました。 SDV は SAXS 実験を実行しました。 SDV と DS は SAXS データの分析と解釈を実行し、対応するセクションを作成しました。 BEB と KA はパルス EPR 実験を実行し、データを分析し、図を作成し、対応するセクションを書きました。 KBとJLS-B。 RNase シーケンスアッセイを設計し、実行しました。 CR、MFW、HC、NS、GH がデータを分析し、論文を執筆しました。著者全員が結果について議論し、すべての段階で原稿についてコメントしました。

Christophe Rouillon または Gregor Hagelueken との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Simon Jackson 氏、David Taylor 氏、その他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ａ、ＣａｌｐＬのゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６０）。挿入図: クロマトグラムの青いバーで示された画分の SDS-PAGE 分析。実験は複数回実行されました (n > 3 生物学的複製)。 b、TMHMM 2.0 サーバー 28 による TM 予測と実験構造。 c、SeMet CalpL 結晶構造の代表的な電子密度。構造モデルは球と棒の表現で描画されます。選択された残基は標識されます。黒いメッシュは、1.0 σ で等高線化された 2mFo-DFc 電子密度マップです。 d、CalpLのトポロジー図。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

ソースデータ

a、CalpL は、図 1 のように色分けされた漫画モデルとして描かれています。T. onnorineus の Lon プロテアーゼ (PDB-ID: 3K1J、DALI Z スコア: 12.8)76 は、白い漫画モデルとして示されています。 b、類似のドメイン構造を持つタンパク質をリストした表17、23、27、29、30、76、77、78。 c、Lonプロテアーゼ活性部位領域の表面静電図。触媒ダイアドがマークされています。灰色の線は、おそらく基質結合部位を示しています。 d、CalpL活性部位とキハダ腹水炎ウイルスプロテアーゼのアシル酵素中間体との重ね合わせ。 CalpL は図 1 のように棒で表示され、色分けされています。構造 4IZJ27 の鎖 D (残基 630 ～ 640) は、CalpL の対応する残基 (150 ～ 160) に重ねられ、rmsd は 0.314 Å になりました。 4IZJ のうち、アシル酵素中間体のみがスティックモードで表示されます。選択された残基と P1 ～ P3 部位の位置が示されています。 e、CalpL（図1のような配色）とCap4タンパク質（白、PDB-ID：6VM6）の重ね合わせ23。 f、CalpL SAVED ドメイン（図 1 の配色）と Can1 タンパク質（白色、PDB-ID: 6SCE）の重ね合わせ。 g、CalpL SAVED ドメイン (図 1 の配色) と Cap5 タンパク質の CARF ドメイン (白色、PDB-ID: 7RWK) の重ね合わせ。

a、CalpL の保存されたドメインに結合した cA4 (緑色) の拡大図。青いメッシュは、1.0 σ で等高線化された 2mFo-DFc 電子密度マップです。 b、cA4複合体構造上へのCalpL apo（白）の重ね合わせ（図1のように色分け）。 c、CALP/cA4およびCap4/cA3の保存されたドメインの構造アラインメント（白色）。

a、b、MazF/ssRNA複合体の1つのモノマー（紫/オレンジ）と予測されたCalpT構造（図2Bと比較）の重ね合わせ（PDB-ID：5CR2）79。 AlphaFold233 予測信頼度は CalpT 構造にマッピングされます (pLDDT48、予測された局所距離差検定)。 b, 予測された CalpT 構造 (図 2b と比較) と MazE/F 複合体の 1 つのモノマー (PDB-ID: 4ME7) の重ね合わせ。 AlphaFold233 予測信頼度は CalpT 構造にマッピングされます (pLDDT48、予測された局所距離差検定)。ｃ、ＣａｌｐＴのゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１６／６０）実験は複数回行われた（ｎ＞３の生物学的反復）。図 3 の MALS データによれば、単離された CalpT はモノマーとして動作します。挿入図: 青いバーで示された画分の SDS-PAGE 分析。 d、切断バンドのペプチドフィンガープリント。示されたゲルバンドはゲルから切り取られ、セントアンドリュース大学 (英国ファイフ、https://mass-spec.wp.st-andrews.ac.uk) の質量分析およびプロテオミクス施設で同定のために提出されました。。赤い文字は、それぞれのサンプルで同定されたペプチドを示します。実験は 1 回実行されました。 e、CalpTにおける潜在的なCalpL切断部位の変異分析。実験は複数回実行されました (n > 3 技術的反復)。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

ソースデータ

a、CalpL/T相互作用のシングルサイクルカイネティクスSPRデータ。相互作用は非常に強力ですが、1:1 結合モデルでは満足のいく適合が得られません。実験は 2 回実行されました (n = 2 技術的反復)。 b、a)と同様ですが、この実験では、CalpTに融合した非特異的VHHの人工構築物を分析物として使用しました。この相互作用は CalpL/T 相互作用に非常に似ています。実験は 2 回実行されました (n = 2 技術的反復)。 c、CalpL切断部位を含む2つの人工構築物の概略図。ｄ、ＣａｌｐＬは、ＣａｌｐＴ１０に融合された非特異的ＶＨＨの人工構築物を切断するが、ＣａｌｐＬ切断部位によって融合された２つのＶＨＨの構築物は切断しない。実験は 1 回実行されました。 e、CalpL S152A、CalpT、およびcA4のさまざまな組み合わせによるタンパク質分解反応のSEC-MALSトレース（実線：UV280、破線：MWMALS）。概略図は、個々のピークの背後にある分子種を示しています。実験はわずかに異なる緩衝液条件で 2 回実行されました (n = 2 技術的反復)。 f、cA4の非存在下でのCalpL wtの示されたCalpT変異体への結合。概略図は、CalpL/T 複合体における変異体の位置を示しています。実験は 1 回実行されました。 g、CalpL/T10 結晶構造の代表的な電子密度。選択された残基は標識されます。黒いメッシュは、1.0 σ で等高線化された 2mFo-DFc 電子密度マップです。 h、CalpL/T10複合体のSEC-SAXS実験。実験は 1 回実行されました。 30 個のサンプル強度フレームと 60 個のバッファー強度フレームが収集され、平均されました。各データセットと角度点について、誤差はポアソン統計に従って計算されました。データ点は平均強度差 (サンプルバッファー) を表し、エラーバーは標準偏差を表します。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

ソースデータ

a、異なるタンパク質濃度および非存在下（t = 0: 明るい灰色から t = 60 分: 濃い灰色）および存在下での動的光散乱実験（6 つの時系列、各系列は破線の円でマークされ、単一のデータ点が表示されます）。 cA4 の (t = 0: シアンから t = 60 分: 紫) は、CalpL の cA4 依存性オリゴマー化を明らかにします。実験は 2 回実行されました (n = 2 の技術的反復) b、異なる濃度での SAXS 実験。実験は 1 回実行されました。各実験について、30 個のサンプル強度フレームと 60 個のバッファー強度フレームが収集され、平均されました。各データセットと角度点について、誤差はポアソン統計に従って計算されました。データ点は平均強度差 (サンプルバッファー) を表し、エラーバーは標準偏差を表します。 c、DAMMIFおよびSASREFMXを使用して、モノマー-ダイマー混合物を異なる濃度にグローバルフィットすることにより作成されたCalpLダイマーのAb initio/剛体モデル（赤線）。 CalpLモノマーの結晶構造も同じスケールで示しています。

ソースデータ

a、6つの蛍光標識されたRNA基質（c）にリストされている）に対するb）の反応のリボヌクレアーゼ活性を決定するための変性PAGEの蛍光画像。 RNA と 60 °C で 30 分間インキュベートした後でも切断は観察されませんでした。実験は３回実施した（ｎ＝３の生物学的複製）ｂ、ＣａｌｐＬによるＣａｌｐＴ（３３ｋＤａ）のｃＡ４誘導性切断のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。切断は 60 °C で 60 分後に完了します。実験は 3 回実行されました (n = 3 の生物学的複製) c、RNA 基質の配列 d、左: MazF を 10 個のランダムな塩基を含む一本鎖 RNA ライブラリーとインキュベートしました。イルミナ配列決定を使用して、MazF によって切断された配列を確認しました。 MazF を含まない対照反応と比較して、既知の MazF 標的部位 (ACA) を含む配列が枯渇しました。右: 同じ実験ですが、MazF の代わりに CalpL/T ± cA4 を使用しました。非対角配列は存在せず、したがって ssRNase 活性も観察されませんでした。実験は 2 回実行されました (n = 2 の生物学的複製)。 e、d)の実験用のオリゴヌクレオチド、f、CalpT23のAlphaFold2二量体モデル。 g、MTSSL スピンラベル 80 を含む最良のモデル (pLDDT48、予測局所距離差検定)。 h、CalpL/T E119R1 の X バンド CW-EPR スペクトル。遊離ラベル (鋭いスパイク) の量は約 10% です。標識効率は ~100% と測定されました。 i、cA4の存在下(赤)および非存在下(黒)におけるCalpL/T E119R1のPELDOR時間トレース。 j、コンセンサス分布と対応する不確実性バンド。色付きのバーは信頼性の範囲を示します (緑色: 信頼できる形状、黄色: 信頼できる平均値と幅、オレンジ色: 信頼できる平均値、赤色: 定量化は不可能)。 mtsslWizard80で計算された予測距離。 EPR 実験は 2 回実行されました (n = 2 技術的反復)。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

ソースデータ

a, CalpS 単独の予測。タンパク質は漫画として示され、予測信頼度 (pLDDT48、予測局所距離差検定) に従って色分けされています。 b、CalpT/S 複合体の予測。 c、CalpSと4LUP81および2H2782の重ね合わせにより、CalpSのDNA結合領域が同定される。 d、結核菌由来のRNAP/ECF σ因子/プロモーター複合体との関連におけるCalpSのモデル(PDB: 5ZX283、灰色、黄色、緑色)。 CalpS の σ2 サブユニットと σ4 サブユニットの間のリンカー領域は、5ZX2 のドメインに σ2 および σ4 ドメインを重ねられるように切断されていることに注意してください。リンカーは、5ZX2 構造 (黄色) の σ 因子と同様の方法で RNAP に結合するのに十分な長さです。

この研究で使用したすべてのゲルのトリミングおよび編集されていないバージョン。

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転載と許可

Rouillon, C.、Schneberger, N.、Chi, H. 他環状ヌクレオチドによる抗ウイルスシグナル伝達は、CRISPR プロテアーゼを活性化しました。 Nature 614、168–174 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

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受信日: 2021 年 12 月 6 日

受理日: 2022 年 11 月 17 日

公開日: 2022 年 11 月 24 日

発行日: 2023 年 2 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

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